龙血素A和龙血素B间接竞争酶联免疫检测方法的研究

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龙血素A(LA)和龙血素B(LB)均为龙血竭的活性成分,也是龙血竭药物质量的中药参考成分。目前多是以高效液相色谱法(HPLC)检测LA和LB的含量。虽然高效液相色谱法具有高灵敏度高分辨率等优点,但是高效液相色谱仪昂贵,实验的前处理步骤也特别繁杂,需要专业的操作人员,致使高效液相色谱法的使用和普及受限。酶联免疫吸附测定方法(ELISA)与高效液相色谱法相比有着独特的优势,ELISA方法简单快速、高通量、高特异性、试剂便宜、使用安全、易于自动化操作,可以极大地提高检测效率并降低检测成本。建立检测LA和LB的ELISA方法具有重要的科学和现实意义。  LA和LB是两种结构相似的小分子物质,不具有免疫原性,要建立它们的酶联免疫检测方法,必须将它们分别与大分子结合形成人工抗原。先将 LA和LB的结构进行修饰,加上一个游离羧基,再分别与牛血清蛋白偶联作为免疫原,与鸡卵清蛋白偶联作为包被原。用免疫原去免疫小鼠,刺激小鼠机体产生特异性抗体,采用间接竞争 ELISA原理检测样品中待测物的含量。主要步骤:使用相应包被原包被酶标板制成固相抗原,已包被的微孔中先后加入待测样品溶液和抗血清进行孵育,样品中的抗原(LA或LB)与微孔表面固定的抗原(LA或LB)竞争结合抗血清中的多克隆抗体,洗涤除去未固定成分,加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG,IgG与固定的多克隆抗体结合,再次洗涤后加入可被HRP催化的显色剂,经硫酸终止反应后的显色程度与样品中待测物的浓度呈负相关,用酶标仪在450/630nm双波长下测定其吸光度,根据标准曲线和样品的吸光度,计算出待测物的浓度。  实验得到的LA多克隆抗体和LB多克隆抗体,其效价分别达到8000和30000。LA和LB的间接竞争ELISA法对LA和LB的最低检测限分别为3.9 ng/ml和26.1 ng/ml;批内精密度分别为 CV≤10.7%和CV≤9.9%;批间精密度分别为CV≤11.5%和CV≤12.3%;回收率范围分别为87.4~110.8%和109.8~113.5%;LA和LB的6种类似物的交叉反应率分别低于9.20%和3.64%;检测得到LA在4种龙血竭药物中的最大含量是最小含量的4.05倍,LB在4种龙血竭药物中的最大含量是最小含量的3.57倍。LA和LB间接竞争ELISA法的检测精密度、准确度和特异性均较好,相比传统的检测方法,本法可快速便捷有效地用于药物检测和分析,给龙血竭的品质鉴定提供了一个全新快捷方便且能够普及的方法。
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