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第一部分神经干细胞的体外分离、培养及鉴定目的:(1)建立小鼠乳鼠大脑皮质神经干细胞的分离、培养方法。(2)鉴定神经干细胞及分化后的细胞,为神经干细胞的体内移植研究奠定基础。方法:体外分离出新生SD小鼠(出生1-3天内)的大脑皮质,机械吹打,采用无血清悬浮培养法,采用DMEM/F12培养基,添加B27, bFGF和EGF等生长因子,调整细胞密度至1×107/L,1×108/L,1×109/L,1×1010/L进行体外培养,倒置相差显微镜观察细胞形态,取得具有自我复制、增殖能力的细胞,并将细胞贴壁培养检测其分化能力,应用多克隆兔抗鼠巢蛋白(Nestin)、多克隆兔抗鼠神经元特异性烯醇化酶(Neuron Specific Enolase NSE)、多克隆兔抗鼠胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗体,免疫组化鉴定细胞。结果:(1)从新生小鼠大脑皮层组织分离出的细胞,在添加B27和EGF、bFGF的DMEM/F12的无血清培养基中,可持续增殖,聚集成神经球。细胞经过贴壁后分化为神经元及神经胶质细胞,此法较简单,为进行NSCs体内移植奠定了基础。(2)MTT实验显示按1×109/L密度培养细胞增殖最快,细胞数量从第3天起迅速增殖,于第7天达高峰。(3)免疫细胞化学法呈现:抗Nestin阳性、抗NSE阳性,抗GFAP阳性。结论:按上述方法分离、培养出的细胞具有自我复制、增殖及分化为神经元和胶质细胞的特性,属于神经干细胞(NSCs)。第二部分新型组织工程多肽的设计合成及自组装成凝胶目的:设计合成含IKVAV的新型组织工程多肽序列,研究其在不同条件下自组装为多孔凝胶及生物力学特性。方法:用传统的固相法合成多肽(上海波泰生物科技有限公司),使用高效液相色谱仪(High performance liquid chromatograph, HPLC)测定纯度,质谱仪(Mass spectrometer, MS)测定分子量;将合成的多肽粉末溶于0.1mol/LNaOH溶液中,配成10,2,1,0.5%wt肽溶液,各取200ul肽溶液,加入等体积的DMEM/F12,涂于盖玻片或置于10mol/L盐酸蒸汽中,置入37℃干燥箱。使用扫描电镜(scanning electron microscope,SEM)及透射电镜(transmission electron microscope,TEM)检测自组装凝胶的结构,凝胶的流变学特性则使用血流计来测定。结果:MS示肽的分子量为1351.72,HPLC示其纯度为95%。多肽在DMEM/F12触发下,数秒内形成凝胶;于10mol/L HCL蒸气中,2小时后形成凝胶薄膜;在37℃恒温干燥箱中,仅见白色肽粉末,未见凝胶;SEM检测10%wt多肽自组装凝胶由许多纳米纤维构成,呈现多孔厚壁结构,TEM示:2,1,0.5%wt多肽自组装凝胶是由相互交叉的编织状纳米纤维构成。1%wt多肽凝胶纤维直径有3.5～5nm,长度95nm～1500nm;2%wt多肽凝胶纳米纤维十分密集;0.5%wt肽凝胶纳米纤维十分细,纤维间有较大的空隙;时间扫描流变学示:损耗模量呈线性比存储模量小,证实自组装凝胶有一定生物力学强度,可支撑接种的细胞。结论:本实验设计合成了新型组织工程多肽,在DMEM/F12中可自组装成多孔凝胶,成功合成了一种含IKVAV等活性区域的新型脊髓组织工程支架材料。第三部分神经干细胞在肽自组装凝胶表面生长、分化的实验研究目的:体外分离培养出NSCS,接种于组织工程多肽自组装多孔凝胶的表面,观察NSCS在二维凝胶表面及其血清,联合因子等条件下生长、分化情况。方法:取小鼠乳鼠的大脑皮质,机械分离,无血清悬浮培养出NSCS,用免疫细胞化学法,链霉亲和素-生物素-过氧化物酶(Streptavidin biotin peroxidase Complex,SABC)检测试剂盒鉴定细胞。多肽溶于NaOH溶液中,浓度为1%wt,PH=9.0,加DMEM/F12在盖玻片上触发多肽自组装为凝胶,TEM检测,实验组:NSCS接种于二维凝胶的表面;对照组:NSCS接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片表面;倒置相差显微镜观察NSCS生长及分化情况,免疫细胞化学染色,激光共焦显微镜观察。将NSCS球接种于用预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上,在NSCS球贴壁后,按以下分组进行诱导分化:(1) 5μmol/ml Forskolin、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF 200 ng/ml神经基因调节剂(HRG),联合因子组;(2)10%血清,血清组;(3)20 ng/ml bFGF, bFGF组。各组的培养基均为为DMEM/F12+B27添加剂。用MAP2阳性细胞计数分化的神经元,Hoechst33342阳性标记数来计数细胞总数。NSCs的神经元分化率=MAP2+细胞数/Hoechst33342标记细胞数。用图像分析软件对采集图像中MAP2阳性的神经元的胞体面积、周长及细胞最长突起长度进行分析。结果:免疫组化鉴定:无血清悬浮培养的细胞为NSCs,抗Nestin阳性。TEM示:凝胶为相互交织成网状的纳米纤维。实验组:7天后,IPCM观察到NSCS长出细长突起,对照组仅见未分化状态的NSCs球。LCM观察:实验组,NSCs发生分化,见神经元及星形胶质细胞,NF阳性,为较强红色荧光,GFAP阳性,为弱绿色荧光;对照组:只见NSCs球,Nestin阳性,为绿色荧光。联合因子组:免疫荧光显示:MAP2阳性细胞沿着S100阳性细胞的突起向外周移行,生长,分化,到诱导10d后,MAP2阳性细胞也出现许多突起,有部分呈现TH免疫阳性。血清组:免疫荧光细胞化学染色见细胞呈S1O0强阳性,Hoechst33342染色见细胞核较大,MAP2阳性细胞数量较少,胞体饱满。bFGF组:免疫荧光检测:诱导3～5d后逐渐呈S100阳性,突起粗短。结论:本课题采用机械分离,无血清悬浮培养出NSCS。TEM证实凝胶为网状纳米纤维。使用免疫细胞化学法进行细胞鉴定:凝胶对NSCS有较好的细胞相容性,NSCS在其表面可被诱导分化为神经元及神经胶质细胞。证实多肽自组装二维凝胶可作为一种神经组织工程支架材料。NSCS在联合因子和血清,bFGF条件下,生长分化存在显著差异.