1型糖尿病(type1diabetes mellitus,T1DM),又称胰岛素依赖型糖尿病或青少年糖尿病,目前普遍的观点认为是免疫学因素、基因和环境等因素共同参与了疾病的发生和发展的结果,其主要特点是细胞介导的胰岛β细胞的损伤。上世纪七十年代初发现的高迁移率族蛋白1(high-mobility group box1, HMGB1),被认为是一种重要的调控转录的核蛋白。HMGB1可使DNA弯曲并促使一些调节蛋白复合物同DNA结合而发挥作用。此外,HMGB1还参与了许多与炎症及组织损伤有关的自身免疫性疾病,如类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)及系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)许多重要的受体参与了HMGB1信号通路,包括toll样家族受体(toll-like family of receptors, TLRs)及晚期糖基化终产物受体(the receptor for advanced glycation end products, RAGE). HMGB1通过TLRs或RAGE活化核因子-κB(nuclear factor-KB, NF-κB)发挥作用,从而诱导促炎细胞因子的生成、白细胞粘附分子的上调、导致组织损伤及炎症反应。尽管胰岛α细胞围绕在胰岛β细胞的外周并形成天然的物理屏障,然而在T1DM的发病过程中,胰岛α细胞却几乎不受影响,而胰岛p细胞则明显受损。非肥胖糖尿病(non-obese diabetic, NOD)小鼠可以自发产生T1DM,且同人类T1DM的发病特点相似,是国际公认的T1DM模型。HMGB1参与了许多自身免疫性疾病的发病过程,T1DM也是一种自身免疫性疾病,然而,HMGB1是否参与了T1DM的发病过程及其可能的作用机制,目前国内外尚未见报道。本研究用免疫组化技术检测HMGB1在NOD小鼠胰腺中的分布后发现,在发病NOD小鼠胞浆中HMGB1的阳性率明显高于未发病组,提示HMGB1可能参与了T1DM的发病过程。进一步检测NOD小鼠不同胰岛细胞表面HMGB1受体的分布情况,证实了HMGB1可以同胰岛细胞表面的TLR4相互作用,且TLR4主要表达于β细胞而非α细胞。接着用基因表达谱芯片检测NOD小鼠糖尿病发病过程中的基因变化。最后阐明HMGB1选择性损伤胰岛β细胞的TLR4信号通路的作用机制。第一部分NOD小鼠在T1DM发病过程中HMGB1的分布和变化特性目的检测HMGB1在NOD小鼠胰腺中的表达、T1DM发病过程中的变化及在胰岛细胞表面其相关受体的分布。方法用NOD小鼠建立T1DM模型,每周检测血糖变化,苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, HE)染色观察发病过程中胰岛的变化,胰岛素染色、激光共聚焦技术检测未发病NOD小鼠和发病NOD小鼠胰岛免疫荧光染色结果,并统计胰岛数目。HMGB1染色并用免疫组化检测HMGB1的多少与胰岛损伤轻重的关系。激光共聚焦技术进一步检测NOD小鼠胰腺胰岛细胞不同细胞表面HMGB1受体的表达情况。结果(1)雌性NOD小鼠最早于4周开始发病,14周-26周发病明显增加,至30周的累积发病率为70%；HE染色镜下观察,未发病NOD小鼠胰腺内可见大小不等的胰岛细胞,细胞呈团索状分布,胰岛结构完整,细胞饱满,细胞间有丰富的毛细血管,胰岛内未见单核细胞或淋巴细胞浸润；发病小鼠胰岛变性、坏死消失,胰岛体积变小、萎缩,胰岛内细胞数量较少,纤维组织增生及玻璃样变；(2)免疫荧光激光共聚焦技术检测：未发病NOD小鼠胰腺可见胰岛β细胞区域有大量胰岛素阳性的红色荧光,胰岛结构完整、细胞饱满,红色荧光区域较广,而发病NOD小鼠胰岛β细胞区域仅出现少量胰岛素阳性的红色荧光,较分散,且分布区域较小；胰岛计数：未发病NOD小鼠胰岛数目较多,发病的NOD小鼠胰岛数目明显减少,由42.5±4.90锐减至30.85±9.24,与未发病组相比有显著的统计学差异(P<0.01)；(3)HMGB1免疫组化染色结果显示：未发病NOD小鼠胰腺组织HMGB1蛋白主要定位于胞核,发病NOD小鼠胰岛损伤明显加重,HMGB1蛋白向胞外释放明显增多。通过镜下计数得到HMGB1从胞核向胞浆的转移率发现,随着NOD小鼠周龄的增加,T1DM症状的加重,胰腺组织中位于胞外的HMGB1明显增加,HMGB1转移率由19.44±5.08上升到79.22±6.92,组间差异有显著统计学差异(P<0.01)；(4)激光共聚焦技术检测NOD小鼠胰腺组织胰岛细胞表面HMGB1受体,TLR2、TLR4、TLR9和RAGE的免疫荧光表达情况：4周未发病NOD小鼠胰腺胰岛细胞表面,几乎所有的胰岛β细胞膜表面均表达TLR4,TLR4主要定位在胞膜,呈绿色荧光,而TLR2、TLR9和RAGE的表达量则很低,甚至完全不表达；(5)进一步检测胰岛α及β细胞表面TLR4的表达情况：分别用胰高血糖素及胰岛素标记4周未发病NOD小鼠胰腺的胰岛α及β细胞,采用免疫荧光双重染色标记方法同时检测TLR4在胰岛α细胞及β细胞上的表达情况。TLR4主要分布于构成胰岛主体的β细胞表面。胰高血糖素阳性的胰岛α细胞呈环状围绕在胰岛周围,其表面仅能看到极少量的TLR4阳性的细胞。结论随着1型糖尿病的进展,HMGB1表达量明显增加,其可能通过免疫机制参与了疾病的发生、发展过程；几乎所有的胰岛细胞表面均表达TLR4,而TLR2、TLR9和RAGE的表达量则很低；胰岛β细胞上HMGB1受体TLR4的表达较α细胞多,对损伤更敏感。第二部分NOD小鼠T1DM发病过程中的基因变化的芯片测定目的基因表达谱芯片检测NOD小鼠糖尿病发病过程中的基因变化。方法经胆管穿刺,逆行灌注1.5～2ml4℃的胶原酶V,分离NOD小鼠的胰腺。将胰腺放入含胶原酶V的D-Hank’s平衡液中,并置于37℃恒温水浴箱中振荡消化。将消化液用含5%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的RPMI1640清洗三遍后用Ficoll分离液进行纯化。分离好的胰岛进一步用毛细吸管手工分选,用Dithizone(DTZ)将胰岛特异性染为腥红色进行鉴定以保证胰岛细胞的纯度；分别提取未发病及发病NOD小鼠胰岛的总RNA,用NanoDrop ND-1000分光光度计及标准的变性琼脂糖凝胶电泳进行样品的质量控制；每组取5μg RNA用于标记及芯片杂交。将扫描得到的图像导入NimbleScan软件(VER2.5)做表达数据等相关分析。通过倍比差异法(fold change filtering)分析表达不同的基因；使用标准富集计算方法(standard enrichment computation method)对表达水平不同的基因行基因本体论(gene ontology, GO)分析及信号通路分析；分层聚类法(Hierarchical clustering)分析两组基因的表达差异。结果(1)Ficoll法分离后仍有少量胰腺外分泌细胞和导管细胞。用毛细吸管将胰岛细胞手工挑选出来后,并将纯化后的胰岛细胞行DTZ染色,在倒置显微镜下观察：刚分离的胰岛,细胞呈圆形或椭圆形,形态完整,有折光性。经DTZ染色后见约95%的细胞团呈猩红色,证明分离的胰岛纯度很高；从电泳图上可以看到三条清晰的5S、18S、28S核糖体RNA (ribosomal RNA, rRNA)条带,且28s rRNA的亮度为18s rRNA的两倍。并且OD260/OD280比值均在1.9-2.0之间,提示总RNA质量很好；(2)同Roche NimbleGen公司含44170个基因的基因组表达谱芯片杂交,将上述扫描得到的图像导入NimbleScan软件(VER2.5),将原始数据标准化,剔除掉表达程度过低的基因,做表达数据等相关分析,共得到1007条差异表达基因,其中上调基因432条,下调基因575条；(3)做箱形图(box plot)比较所有样品的强度分布,可快速可视化数据集的分布；将发病NOD小鼠组和未发病NOD小鼠组的芯片杂交图完全重叠,重叠后的图像用专业软件进行分析,得到芯片杂交的散点图,来评估两组样品之间基因表达变化(或重复性)；(4)GO分析从生物学过程、分子功能和亚细胞组分三个方面对基因的功能进行分类,每个大类又可分为下一级及更下一级的分支,结果显示：在生物学过程中,有885(87.7%)个与代谢相关的基因上调；22(18.97%)个与代谢有关的基因和21个(18.10%)与催化活性(regulation of catalytic)相关的基因下调；在细胞组分方面,上调基因分布比较平均,最高的为细胞及细胞成分,占488个(29.20%)；下调基因主要为细胞骨架(cytoskeleton)、微管细胞骨架(micotubule cytoskeleton)及相关组分57个(78.08%)；上调的分子功能相关基因中,有591个(84.07%)与结合(binding)有关。下调的分子功能相关基因主要为44个(30.77%)水解酶活性(hydrolase activity)、17个(11.89%)酶调节活性(enzyme regulatoractivity);(5)倍比聚集法(fold enrichment)分析后,发现在生物学功能中,上调最明显的是细胞核凋亡过程中形成的DNA碎片(DNA fragmentation)及DNA的分解代谢过程(DNA catabolic process),下调最明显的是软骨细胞的分化调节能力；细胞组分方面,上调最明显的是肌球蛋白复合物(myosin complex)和内含体(endosome),下调最明显的是肌球蛋白复合物Ⅱ和细胞质动力蛋白(cytoplasmic dynein complex);在分子功能中,上调最明显的是脱氨酶活性,下调最明显的是Rac GTP酶活化活性(Rac GTPase activator activity);(6) Pathway分析NOD小鼠T1DM发生过程中明显上调的信号通路为黏蛋白型O聚糖合成信号通路(mucin type O-Glycan biosynthesis)基因下调的信号通路主要为血管加压素信号通路(vasopressin-regulated water reabsorption);通过分析与本课题相关的基因,发现TLR4信号通路中含TIR的接头蛋白(TIR domain-containing adapter protein, TIRAP)及下游信号分子被激活。结论在T1DM的发病过程中,多条信号通路被激活；通过分析与本课题相关的基因,发现TLR4信号通路中TIRAP及下游信号分子被激活。第三部分HMGB1选择性损伤胰岛p细胞的TLR4信号通路目的HMGB1如何同胰岛β细胞的TLR4结合及其参与损伤胰岛β细胞的机制。方法分离并纯化未发病NOD小鼠胰岛后体外培养；不同剂量HMGB1干预后用TUNEL法检测胰岛细胞的凋亡情况；为进一步研究HMGB1同其相对应受体的结合能力,将胰岛细胞先分别同TLR2、TLR4、TLR9及RAGE抗体预孵育后再同NHS-Fluorescein标记的HMGB1孵育,并用激光共聚焦技术检测其结合能力；用Western Blotting技术检测NOD小鼠发病不同时期胰腺HMGB1及TLR4蛋白的表达；用实时荧光定量PCR技术对NOD小鼠糖尿病发病全程胰腺HMGB1及TLR4mRNA表达水平进行测定；通过ELISA技术检测小鼠外周血血清中炎症细胞因子浓度的改变,进而了解全身性炎症反应水平的变化情况。结果(1)不同浓度HMGB1干预,TUNEL法检测凋亡：高浓度HMGB1(15μ g/mL)组胰岛细胞内TUNEL阳性的胰岛细胞核数为(20.31±2.36),较低浓度HMGB1(10μg/mL)组胰岛细胞内TUNEL阳性的胰岛细胞核数(5.56±1.71)及HMGBK5μg/mL)组胰岛细胞内TUNEL阳性的胰岛细胞核数(2.86±1.36)明显增加,组间有明显统计学差异(P<0.01),且HMGB1同凋亡数成正比,表明HMGB1可以促进胰岛细胞的凋亡；(2)HMGB1可以与胰岛细胞表面的TLR4特异性结合：胰岛细胞分别同TLR2、TLR9、RAGE或IgG预孵育后并不影响胰岛细胞同HMGB1的结合,然而,同IgG处理过的对照组相比,用TLR4抗体及未标记HMGB1预孵育后明显降低了胰岛细胞同HMGB1的结合能力。上述结果提示：HMGB1可以同胰岛细胞表面的TLR4相互作用；(3)用、Western Blotting及实时荧光定量PCR技术分别从蛋白水平及信使RNA水平检测NOD小鼠在自然发病过程中HMGB1及TLR4表达量的变化趋势。Western Blotting检测发现：在未发病NOD小鼠中HMGB1及TLR4蛋白的表达量较低,而在发病早期(10W～14W)其表达量明显增加(P<0.01),在疾病晚期,HMGB1及TLR4蛋白的表达明显下调(P<0.01)；在NOD小鼠糖尿病的发病过程中,每3周～5周检测胰腺HMGB1及TLR4mRNA的表达变化。分析结果表明：8周以前的NOD小鼠其胰腺中HMGB1mRNA的表达无明显变化。然而,在10周时,胰腺中HMGB1mRNA的表达水平显著升高,上升程度约为4周时的(8.83-11.59)倍,然后缓慢下降直至接近于8周HMGB1mRNA的水平。NOD小鼠TLR4mRNA的表达同HMGB1mRNA变化趋势相近,6周时NOD小鼠TLR4mRNA的表达水平较4周时明显升高。然而这一过程很短暂,在接下来的8周至10周,TLR4mRNA的表达量持续上升,定量分析提示,第10周时其表达水平约为第4周的(14.03-8.58)倍,而后其表达水平逐渐下降。Western Blotting及实时荧光定量PCR数据表明：胰岛β细胞表面TLR4的过表达同T1DM的进展及HMGB1的表达密切相关。(4) ELISA结果提示,与未发病组相比,发病组NOD小鼠外周血中白介素(interleukin,IL-13(P<0.01)、IL-6(P<0.05)及干扰素(interferon, IFN)-γ(P<0.01)的浓度均出现不同程度的上升。以上数据表明,随着T1DM的进展,HMGB1、TLR4的过表达、二者结合后导致TLR4信号通路的激活,能够改变全身性炎症细胞因子的分泌特征,增加促炎细胞因子的分泌,提高T1DM时机体内的抗炎水平。结论TLR4是胰岛p细胞表面的主要受体,在T1DM的发病过程中,HMGB1可以选择性地同胰岛β细胞而不是胰岛α细胞结合,选择性损伤胰岛β细胞；胰岛β细胞表面TLR4的过表达同T1DM的进展及HMGB1的表达密切相关。TLR4在胰岛β细胞中不仅表达上调,而且发挥着相应的功能,激活的TLR4信号通路可通过活化IL-1β、IL-6、IFN-γ等下游炎症因子,引起局部炎症样反应,达到选择性破坏胰岛β细胞并使其功能衰竭,最终导致体内胰岛素分泌不足,糖尿病症状进行性加重。