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研究背景与目的内脏高敏感（Visceral Hypersensitivity,VH）是指内脏对生理性或伤害性刺激的耐受阈值降低的现象。目前认为,内脏高敏感是产生功能性胃肠病症状的主要病生理机制之一,腹痛和烧心是内脏高敏感的常见临床表现,常见于肠易激综合征（Irritable bowel syndrome,IBS）、功能性消化不良（上腹痛综合征）（Functional Dyspepsia,FD）和胃食管反流性疾病（Gastroesophageal reflux disease,GERD）等患者中。患者的内脏高敏反应多在某些特定条件的刺激下出现,例如特殊食物的接触、温度变化、酸暴露以及心理压力等。食用谷氨酸钠（Monosodium Glutamate,MSG）作为一种常见的食物增味剂,常被添加在食物中以增加鲜味。临床观察及试验表明,易感人群在摄入MSG后会出现头痛、肌肉紧张、麻木、疲软和脸部潮红等躯体症状,或是出现腹痛、腹胀和腹泻等消化道症状,被称为“谷氨酸钠症候群”。既往动物实验表明,急性摄入大量或慢性长期摄入MSG会导致躯体疼痛阈值的下降,但目前关于MSG对内脏高敏的影响和机制研究尚不明确。Tas1r1/Tas1r3受体是味蕾上感受MSG的主要鲜味受体,II型味觉细胞受到MSG刺激后释放ATP,一种重要的疼痛相关神经递质。最近有研究表明,Tas1r1/Tas1r3还分布在一类特殊的消化道上皮细胞——“Tuft细胞”的表面,其有着与II型味觉细胞类似的味觉传导信号通路,可能在MSG引起的内脏高敏感中起着重要的作用。本研究旨在通过体外体内试验,探究食用谷氨酸钠造成胃部内脏高敏感的机制,探究tuft细胞在这一反应中的作用,为缓解功能性胃肠病患者的内脏高敏感提供全新的治疗策略,改善患者生活质量。研究内容和方法1.MSG对小鼠胃敏感性的影响:给予C57BL/6小鼠低、高浓度的MSG灌胃,检测MSG刺激后小鼠对于胃部球囊扩张刺激的耐受阈值,记录小鼠斜方肌在不同球囊压力大小下的肌电活动,探究在体MSG刺激对小鼠内脏敏感性的影响。小鼠预灌胃Tas1r1/Tas1r3受体抑制剂（Gurmarin）,再给予MSG灌胃后检测小鼠对胃部球囊扩张的肌电反应,探究味觉受体在MSG引起的内脏高敏感中的作用。分别给小鼠腹腔注射三磷酸腺苷（ATP）受体抑制剂（Oxidized ATP,o ATP）和5-羟色胺（5-HT）受体抑制剂（昂丹司琼）进行预处理,再给予MSG灌胃后检测小鼠对胃部球囊扩张的肌电反应,在体探究ATP和5-HT在MSG引起的内脏高敏感中的作用。2.MSG对胃窦上皮细胞的影响及机制探究:建立体外原代单层胃窦上皮细胞模型,采用不同浓度MSG（5,50 and 100 g/ml）刺激细胞,检测刺激后培养液中ATP和5-HT的含量,探究MSG刺激对胃窦上皮细胞的影响。通过Tas1r1/Tas1r3受体抑制剂Gurmarin预处理和小干扰RNA（si RNA）敲降Tas1r1/Tas1r3表达,检测MSG刺激后胃窦上皮细胞疼痛相关物质的含量,探讨Tas1r1/Tas1r3在MSG引起的胃窦上皮细胞反应中的作用。3.胃tuft细胞在MSG诱导的疼痛相关物质释放中的作用:构建荧光标记Ch AT表达细胞的转基因小鼠Ch AT Cre;Rosa26m T/m G（Ch AT-EGFP）,采用免疫荧光染色法,在小鼠胃组织切片上分别进行tuft细胞标记蛋白DCLK1、Tas1r1受体蛋白和Tas1r3受体蛋白染色,分析Tas1r1/Tas1r3在胃组织中的表达情况。利用Ch AT-EGFP小鼠的单层胃窦上皮细胞,进一步进行Tas1r1/Tas1r3染色,明确Tas1r1/Tas1r3在胃窦上皮细胞中的表达情况。构建Ch AT阳性tuft细胞特异性表达白喉毒素受体的转基因小鼠Ch ATCre;Rosa26i DTR+（Ch AT-DTR）并以Ch AT-EGFP小鼠为对照小鼠,利用转基因小鼠胃上皮细胞类器官培养单层胃窦上皮细胞,采用白喉毒素（Diphtherin toxin,DT）选择性敲除胃窦上皮细胞中的Ch AT阳性tuft细胞,再检测MSG刺激后胃窦上皮细胞疼痛相关物质的释放水平,探讨tuft细胞在MSG刺激引起的胃窦上皮细胞疼痛相关物质释放过程中的作用。研究结果1.MSG作用于Tas1r1/Tas1r3受体介导ATP信号通路导致胃部高敏感:（1）低、高浓度MSG（0.1和0.4 mg/g小鼠体重）灌胃后,小鼠胃部因球囊扩张引起的肌电活动显著增加2-3倍,高浓度MSG引起的小鼠肌电活动增加较对照组存在统计学差异（P＜0.05）;（2）Tas1r1/Tas1r3受体抑制剂Gurmarin显著抑制MSG导致的小鼠胃部对球囊扩张的高敏反应（P＜0.05）;（3）ATP受体抑制剂o ATP显著抑制MSG引起的小鼠胃部高敏感（P＜0.05）,而5-HT受体抑制剂昂丹司琼对于MSG引起的胃部高敏感无作用（P＞0.05）。2.MSG通过Tas1r1/Tas1r3受体激活体外胃窦上皮细胞ATP的释放:（1）不同浓度MSG（5、50 and 100 g/ml）刺激原代单层胃窦上皮细胞后,细胞释放ATP量较阴性对照（PBS）呈浓度依赖性增多（分别增多1.8倍、3倍和4.2倍,P＜0.05）,而5-HT释放量无显著差异（P＞0.05）。（2）Gurmarin预处理原代单层胃窦上皮细胞后,MSG刺激引起的细胞ATP释放被显著抑制,与阴性对照（PBS）刺激后产生的细胞ATP释放量无差异（P＞0.05）。（3）Tas1r1 si RNA和Tas1r3 si RNA敲降了原代单层胃窦上皮细胞中Tas1r1和Tas1r3的m RNA表达,敲降率约50%。在受体表达显著下降的细胞中,MSG刺激导致的细胞ATP释放量与阴性对照（PBS）刺激后导致的ATP释放量无统计学差异（P＞0.05）。3.表达Tas1r1/Tas1r3的胃tuft细胞是MSG刺激引起ATP释放的主要来源:（1）Ch AT-EGFP小鼠胃组织的免疫荧光染色证实胃窦上皮细胞中Ch AT阳性的细胞同时表达tuft细胞标志DCLK1;（2）Ch AT-EGFP小鼠胃组织的免疫荧光染色分析发现,Ch AT阳性的tuft细胞表达Tas1r1和Tas1r3受体;其单层胃窦上皮细胞免疫荧光染色也提示,Tas1r1和Tas1r3受体与Ch AT在同一细胞上表达;（3）40ng/ml和100ng/ml的DT可有效敲除Ch AT-DTR小鼠胃窦上皮细胞中的Ch AT阳性tuft细胞,同时造成Tas1r1和Tas1r3受体表达的显著下降,同浓度的DT对Ch AT-EGFP小鼠胃窦上皮细胞无影响;（4）在有效敲除Ch AT阳性tuft细胞的单层胃窦上皮细胞中,MSG刺激诱导的细胞ATP释放量与阴性对照（PBS）刺激后诱导的ATP释放量无统计学差异（P＞0.05）。研究结论1.谷氨酸钠可引起小鼠胃部高敏反应;2.谷氨酸钠通过激活味觉受体Tas1r1/Tas1r3,引起胃窦上皮细胞ATP释放,造成内脏高敏感;3.胃窦上皮细胞中表达Tas1r1/Tas1r3的tuft细胞可能是MSG刺激引起的ATP释放的主要来源,tuft细胞是参与内脏高敏感发生的重要细胞。