目的:CD19嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞是治疗复发难治B细胞淋巴瘤的有效手段,仍有部分患者疗效不佳,分析这部分患者特征,提出针对此部分患者的改进的CAR-T治疗方法。本研究通过临床患者疗效分析结果提示巨块型是CAR-T疗效不佳因素,设计巨块型B细胞淋巴瘤动物实验,采用放疗联合CAR-T细胞的措施,进一步分析放疗对免疫的影响的以及不同的放疗分割方式对CAR-T细胞疗效的影响,以及可能的机制研究,进一步阐明改进的放疗分割方式和CAR-T细胞治疗的最佳联合方式。材料和方法:纳入天津市第一中心医院血液科自2017年2月1日至2019年1月31日,接受CD19 CAR-T细胞治疗的临床试验的34例复发难治B细胞淋巴瘤患者。第一部分:接受CD19 CAR-T细胞治疗的B细胞淋巴瘤患者,检测CAR-T体内扩增数量,评估疗效以及不良反应。第二部分:对接受CD19 CAR-T细胞治疗的复发难治B细胞淋巴瘤患者疾病特征分析,包括疾病的病理类型、输注CAR-T前的疾病状态、疾病分期、B症状、结外受累、巨块型(直径≥7cm)、骨髓受累、乳酸脱氢酶水平、β2微球蛋白水平、不良遗传学、双打击或双表达以及CAR-T治疗是否为二线治疗或二线以上治疗因素,得出疗效不佳患者的特征,为此部分患者提出CAR-T细胞的联合治疗方案;第三部分:针对巨块型是CAR-T细胞疗效不佳的因素,设计放疗联合CAR-T细胞治疗的方案。1、制备CD19 CAR-T细胞和建立巨块型的小鼠模型;分别体内体外炎症CAR-T细胞对淋巴瘤细胞株的疗效。2、不同的放疗分割方式,包括常规的2Gy和大分割的4Gy,8Gy方式对免疫的影响,利用血细胞分析仪和流式细胞技术分析放疗对白细胞,淋巴细胞以及淋巴细胞亚群,包括CD4,CD8和Treg细胞的影响。3、不同分割方式的放疗联合CAR-T细胞治疗对CAR-T治疗巨块B细胞淋巴瘤疗效的影响,从肿瘤微环境以及肿瘤浸润淋巴细胞情况分析可能的机制。4、放疗以及CAR-T细胞均可引起炎症反应,观察检测两者联合治疗的副反应,以及对副反应的管理。第四部分,从一个CAR-T细胞治疗后发生重症CRS的患者提出血浆置换能去除过多的细胞因子,快速缓解CRS相关症状。结果:第一部分:CD19 CAR-T细胞治疗复发难治B细胞淋巴瘤的疗效和安全性分析。1、患者输注CART细胞后,CR率为45.5%,ORR率为77.3%;2、外周血液中检测CD19 CAR-T细胞增殖,增殖的高峰在为治疗后7天(1～19天);外周血CAR-T细胞占总的T淋巴细胞的7.08%(2.23%～28.60%);3、CAR-T细胞输注相关的不良反应:22例患者输注CART细胞后14例患者发生不同程度的CRS,其中9例为1级CRS,4例为2级CRS,其中1例复发难治患者发生3级CRS,经糖皮质激素,白介素6抗体治疗后CRS得到控制。CRS多出现在治疗有效的患者中,治疗有效的17例患者中发生CRS 14例,治疗无效的5例患者中均未发生CRS。在难治复发高肿瘤负荷患者发生CRS的严重程度比肿瘤负荷低患者程度高。第二部分:复发难治B细胞淋巴瘤患者输注CD19 CAR-T细胞后,分为有效组和疗效不佳组,分析这两组患者特征。1、这两组患者CD19 CAR-T细胞输注数量中位数分别为8.6(5.0～12.7)×10~6/kg和9.7(5.8～15.0)×10~6/kg,差异没有统计学意义(P=0.654);外周血检测CAR-T细胞扩增数量,有效组和疗效不佳组CD19 CAR-T细胞占T淋巴细胞的百分比分别为10.28%(3.92～44.16%)和4.05%(0.92～28.63%),有效组比疗效不佳组CAR-T细胞扩增的比例更高,两者比较差异没有统计学意义(P=0.371)。2、分别对两组患者疾病的病理类型、输注CAR-T前的疾病状态、疾病分期、B症状、结外受累、巨块型(直径≥7cm)、骨髓受累、乳酸脱氢酶水平、β2微球蛋白水平、不良遗传学、双打击或双表达以及CAR-T治疗是否为二线治疗或二线以上治疗因素进行单因素分析,结果提示具有巨块型是影响CD19 CAR-T细胞疗效的不利因素,差异具有统计学意义(P=0.001)。应用logistic回归多因素分析结果显示具有巨块型肿物特征仍然是本组患者CD19 CAR-T细胞疗效不佳的独立预后因素,(P=0.005,OR=0.039)。第三部分:不同分割方式放疗联合CAR-T细胞治疗的动物实验。1、放疗不同程度的杀伤肿瘤细胞,但是不能根除肿瘤。不同的治疗组A组:2Gy×5次,B组:4Gy×5次和C组:8Gy×3次分割方式的X线照射。B和C组比A组肿瘤体积明显缩小,在第7天和第14天,比较肿瘤体积的大小,差异有统计学意义(P<0.05)。但是这三种分割方式不足以使体积300m~3大小的肿瘤得以治愈,照射后2周肿瘤再次生长。2、确定放疗对免疫的影响以及与CAR-T细胞联合治疗时间。放疗后24小时白细胞即出现明显的下降,3天后回复至接近正常水平,7天后回复至正常。考虑到放疗对白细胞的作用时间短暂,与CAR-T细胞的联合方法中,于放疗后24小时即注射CAR-T细胞。放疗对淋巴细胞亚群的影响,大分割放疗对T细胞和B细胞明显的杀伤作用,两者比较没有统计学差异(P=0.67),而传统的分割方式对T,B细胞影响不大,可能与放疗次数少有关而不管何种方式的放疗都会使CD4/CD8比值上升,经过3～7天后恢复至正常水平,这可能是机体为逃避放疗引起的损伤的机制,外周血中Treg细胞在3～7天也会明显升高,起免疫抑制作用。3、不同分割放疗联合CAR-T的疗效。大分割放疗的联合方式能迅速的使瘤体缩小,治疗后第7天时肿瘤不能被测到,且延长了CAR-T细胞疗效时间,使小鼠生存期得到延长,A,B,C,D各组生存期分别是45天(39～69天),52天(39～70天),103天(78～182天)和100天(82～193天)。4、大分割放疗增强CAR-T细胞疗效的可能机制。单纯CAR-T组和2Gy组比较,浸润T淋巴细胞的比例差异无统计学意义P=0.37(P>0.05),说明传统的放疗方式不足以促进T淋巴细胞浸润肿瘤;但是大分割方式的放疗,可以对T淋巴细胞浸润肿瘤起促进作用,四组不同分割方式T淋巴细胞在肿瘤组织中所占百分数分别为(2.13±0.11%),(2.77±0.21%)(7.63±0.49%)和(8.53±0.62%)。所有小鼠外周血中均能检测到CAR-T细胞,高峰时间为治疗后第2～7天,中位数为第3天;CD19 CAR-T细胞占T淋巴细胞的百分比分别为23.17%(7.92%～52.16%)和14.05%(5.90%～28.06%),大分割放疗比传统放疗组CAR-T细胞扩增的比例更高,两者比较差异没有统计学意义(P=0.263)。5、联合治疗的不良反应,包括疼痛分级和体重。出现不良反应的中位时间为输注后第1天(第0～7天)。出现3级以上的不良反应小鼠在2Gy组占2只,而4Gy组占5只,8Gy组有7只,其中8Gy组有1只小鼠在CAR-T治疗后1天疼痛级别4级,给予甲强龙干预后好转。每组患者的小鼠均有不同程度的体重下降,其中8Gy组最明显,差异无统计学意义(P=0.151)。第四部分:CAR-T细胞治疗后发生3级CRS的患者,常规糖皮质激素和白介素6受体拮抗剂治疗后CRS无明显改善,出现精神障碍,血压下降及高热,检测细胞因子达高水平(IL-2R:7500U/ml,IL-6:1000pg/ml,IL-8:103pg/ml,IL-10:615pg/ml,TNF-a:40.6pg/ml,INF-γ:670.8ng/ml,CRP:232.8mg/L),应用血浆置换后3次后,细胞因子水平明显下降(IL-2R:7500U/ml,IL-6:43.1pg/ml,IL-8:64.2pg/ml,IL-10:11.7pg/ml,TNF-a:25.2pg/ml,INF-γ:31.2ng/ml,CRP:14.17mg/L),CRS相关临床表现迅速改善,血象恢复,骨髓缓解。结论:1、CD19 CAR-T是复发难治B细胞淋巴瘤的有效治疗手段,副反应可控。2、B细胞淋巴瘤患者特征中巨块型是CAR-T细胞疗效不佳的因素。对具有疗效不佳特征的患者联合使用CAR-T细胞治疗有望使这部分患者受益。3、大分割的放疗方式联合CAR-T细胞治疗可改善巨块型B细胞淋巴瘤小鼠模型的疗效,延长生存,可能与增加肿瘤浸润T淋巴细胞有关,需要注意的是两种联合治疗后副反应的管理。4、血浆置换疗法是治疗重症CRS的有效措施之一。