非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin lymphoma,NHL）是一组具有高度异质性的淋巴组织恶性增殖性疾病,是血液系统最常见的恶性肿瘤之一。弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是最常见的侵袭性NHL,占所有初治NHL的30%-40%,在形态学、生物学、免疫表型、遗传学及临床表现等方面均表现出高度的异质性。随着以利妥昔单抗为代表的新型分子靶向药物、免疫调节药物及细胞治疗的发展和临床应用,DLBCL患者的临床治疗效果和预后得到极大改善,但是仍有超过三分之一的患者出现原发耐药或完全缓解后复发而不能治愈。对于首次治疗失败或者短期复发的DLBCL患者,虽然高剂量的解救性化疗和造血干细胞移植可以改善临床治疗效果,但是多数患者仍然会出现疾病复发,甚至最终进展至死亡,造成了极大的社会及经济负担。随着生物医学大数据时代的到来和多组学测序的发展,对淋巴瘤发生发展的分子学机制及遗传学特征的了解逐步深入,基于新型分子靶点和靶向药物的精准医疗为DLBCL患者的诊治提供了前所未有的机遇。因此,寻找DLBCL复发、耐药和疾病进展的分子标志物,建立新型靶向治疗和干预策略,对于提高DLBCL患者的临床疗效和预后具有重要的意义。Lipocalin 型前列腺素 D 合成酶（Lipocalin prostaglandin D synthase,L-PGDS,又称PTGDS）,位于人类第9号染色体,是Lipocalin家族中的一员,具有催化前列腺素代谢和脂质转运的双重功能。多项研究发现PTGDS具有调节实体肿瘤细胞增殖、转移和干细胞特性等生物学功能,且其表达水平与肿瘤患者的分期、转移及预后等临床指标显著相关。糖基化是一种重要的蛋白质修饰方式,糖基化修饰水平可影响糖蛋白的空间结构、降解及生物学活性,PTGDS基因编码的190个氨基酸可在粗面内质网和高尔基复合体上发生糖基化,成熟的PTGDS蛋白具有一定的糖类和复合型寡糖结构。PTGDS蛋白的氨基端有富含疏水氨基酸的信号肽,提示其可以被分泌到细胞外进入血清、脑脊液和尿液等体液中发挥作用,目前已有多项研究证实体液中的PTGDS浓度水平可以反映机体多种疾病的状态,且加入外源性PTGDS可影响肿瘤的发生发展。AT56是一种具有口服活性的PTGDS特异性抑制剂,可竞争性抑制PTGDS蛋白的生物学活性,尚未有研究报道AT56在肿瘤中的作用及潜在治疗价值。综上所述,糖蛋白PTGDS及其抑制剂AT56在弥漫大B细胞淋巴瘤中的生物学作用及分子机制仍有待深入探讨。本研究旨在探讨糖蛋白PTGDS及其抑制剂AT56在DLBCL发生发展中的作用及分子机制,阐明PTGDS在DLBCL中的表达水平及临床相关性,为DLBCL的早期诊断及预后评估提供新型生物标志物,揭示PTGDS及其抑制剂AT56在DLBCL发生发展中的生物学作用,探讨PTGDS对MYH9及Wnt-β-catenin-STAT3信号通路的调节作用,探究糖基化对PTGDS蛋白稳定性、胞内定位及生物学功能的调节作用,为DLBCL患者的精准靶向治疗提供新型分子靶点,为AT56在DLBCL治疗中的应用奠定理论依据和实验基础。第一部分:PTGDS在弥漫大B细胞淋巴瘤中的表达水平、生物学功能及临床意义目的:弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）是一类具有高度异质性的恶性肿瘤,近年来随着新型靶向药物及细胞和免疫治疗的发展和临床应用,大多数DLBCL患者可获得治愈,但是仍存在超过三分之一的患者出现原发耐药或复发而不能治愈,最终进展至死亡,临床亟待新的分子标志物和治疗靶点以推动DLBCL的个体化精准诊疗方案的建立,从而提高患者的临床疗效和预后。多项研究表明PTGDS在实体瘤中存在异常表达,且与肿瘤患者的临床分期和预后密切相关,然而PTGDS在血液肿瘤尤其是DLBCL中的表达及生物学作用目前尚无研究报道。本研究旨在阐明PTGDS在DLBCL患者肿瘤组织、血清和细胞株中的表达水平,分析PTGDS表达水平与患者的临床特征及预后的相关性,为DLBCL患者的早期精准诊断和预后评估提供新的生物标志物,同时,通过外源性加入PTGDS、慢病毒过表达及敲减PTGDS在体外及体内实验中揭示PTGDS在DLBCL发生发展中的生物学作用,探讨PTGDS作为DLBCL精准靶向治疗方案中新型分子靶点的潜在价值。材料与方法:1.DLBCL及反应性淋巴结增生的病例选择、临床信息及标本的收集;2.免疫组织化学染色（Immunohistochemistry,IHC）及苏木素伊红染色（Hematoxylin-eosin,HE）;3.DLBCL患者及健康对照的外周血的收集与处理;4.酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）;5.外周血单个核细胞中CD19+B细胞的分离和纯度检测;6.蛋白提取和蛋白质免疫印迹分析（Western blotting）;7.基于GEO数据库的生物信息学分析;8.DLBCL细胞培养;9.Cell counting kit-8（CCK-8）检测 DLBCL 细胞的增殖水平;10.慢病毒载体介导PTGDS的过表达与敲减;11.CellTiter-Glo Luminescent 检测细胞生存活力;12.构建DLBCL异种移植小鼠模型;13.PI/RNase法检测细胞周期;14.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡水平;15.Transwell检测细胞的侵袭能力;16.统计学分析。结果:1.纳入120例初治DLBCL患者肿瘤标本和32例反应性淋巴结增生标本进行免疫组织化学染色,结果显示相比于反应性增生淋巴结,PTGDS在DLBCL组织中表达水平显著增高（p＜0.001）。PTGDS在淋巴瘤组织的生发中心中明显高表达,但是PTGDS在对照淋巴组织的生发中心的表达则为阴性,表明PTGDS在淋巴瘤细胞中的特异性高表达。纳入53例DLBCL患者和17例健康对照的外周血血清进行ELISA检测,结果显示PTGDS在DLBCL患者血清中的浓度显著高于健康对照（p＜0.01）。Western blotting结果表明DLBCL细胞株（LY1,LY3,LY8,VAL）中PTGDS蛋白的表达水平高于健康对照外周血单个核中的CD19+B细胞。2.结合DLBCL患者的临床指标进行统计学分析,发现PTGDS高表达与DLBCL患者的GCB亚型、较低唾液酸水平及较差治疗效果密切相关（p＜0.05）。Kaplan-Meier生存曲线分析结果显示,PTGDS高表达的DLBCL患者具有更短的无进展生存期（29个月vs 55个月,p=0.003）和总生存期（31个月vs 62个月,p=0.001）。有趣的是,在non-GCB亚型中,PTGDS高表达与更短的无进展生存期（p=0.004）及总生存期（p=0.004）密切相关,但在GCB亚型中则无统计学意义（p＞0.05）。3.对公共数据库中GEO数据集GSE31312（GPL570,n=498）的数据进行生物信息学分析,GO（Gene ontology）分析显示PTGDS与DNA损伤、细胞增殖与死亡、细胞黏附与迁移、细胞凋亡等肿瘤相关生物学过程密切相关。外源性加入PTGDS及其代谢产物PGD2可显著升高DLBCL细胞的增殖水平,且具有浓度依赖性。构建PTGDS敲减慢病毒（sh-PTGDS#1,sh-PTGDS#2）,PTGDS过表达慢病毒（LV-PTGDS）以及阴性对照慢病毒并转染DLBCL细胞（LY1,LY3）,通过Western blotting实验验证慢病毒介导的过表达及敲减效率,其中sh-PTGDS#2敲减效率最高。PTGDS敲减可显著抑制DLBCL细胞生存、细胞增殖及增殖相关蛋白c-myc的表达水平,PTGDS过表达则可促进DLBCL细胞的增殖。在异种移植小鼠模型中,过表达PTGDS的肿瘤细胞具有更高的生长速度、肿瘤体积、肿瘤重量、活体成像生物发光强度和Ki-67阳性率,敲减PTGDS的肿瘤细胞则出现相反的结果。4.流式细胞实验结果显示,PTGDS敲减可促进DLBCL细胞中的G0/G1期阻滞（p＜0.01）,且降低介导G1期向S期转化的Cyclin D1及CDK2的表达水平。敲减PTGDS的DLBCL细胞凋亡水平明显增高（p＜0.05）,而且促凋亡蛋白（Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9 和 cleaved-PARP）的表达水平升高,抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达水平下降。此外,Transwell结果显示敲减PTGDS的DLBCL细胞的侵袭能力明显降低,且细胞中侵袭促进因子zeb1和vimentin的表达水平显著下降。研究结果提示:PTGDS参与DLBCL的发生发展。结论:1.PTGDS在DLBCL中显著高表达,且其表达水平与患者的临床特征、治疗效果及不良预后密切相关,提示PTGDS可作为DLBCL疾病进展及预后评估的生物标志物。2.体内及体外实验证实PTGDS可通过调节细胞生存、增殖、周期、凋亡及侵袭等生物学过程参与DLBCL的发生发展,研究结果表明PTGDS有望成为新型DLBCL治疗的分子靶点。第二部分:PTGDS特异性抑制剂AT56在弥漫大B细胞淋巴瘤中的抗肿瘤作用目的:近年来,随着精准医学理念的提出及靶向干预策略的发展,多种新型分子靶向药物在肿瘤治疗,包括恶性血液系统疾病的治疗中取得较好的抗肿瘤效果。本研究旨在通过开展体外及体内实验,阐明PTGDS特异性抑制剂AT56对DLBCL细胞生存、增殖、周期、凋亡及侵袭等生物学功能的影响,进一步研究AT56处理的DLBCL细胞对临床常用化疗药物的敏感性的改变,揭示AT56在DLBCL精准靶向治疗及联合化疗中的潜在应用价值,为提高DLBCL患者的预后及临床获益提供新的治疗策略。材料和方法:1.DLBCL细胞培养;2.酶联免疫吸附实验（ELISA）;3.CellTiter-Glo Luminescent 检测细胞生存活力;4.CCK-8检测DLBCL细胞的增殖水平;5.蛋白提取和蛋白质免疫印迹分析（Western blotting）;6.PI/RNase法检测细胞周期;7.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡水平;8.Transwell检测细胞的侵袭能力;9.构建DLBCL异种移植小鼠模型;10.免疫组织化学染色（IHC）及苏木素伊红染色（HE）;11.RNA提取、逆转录和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）;12.彗星实验（Comet assay）检测DNA损伤水平;13.免疫荧光染色（Immunofluorescence,IF）及共聚焦显微技术;14.统计学分析。结果:1.ELISA实验结果显示AT56可降低DLBCL细胞培养上清中PGD2的浓度（p＜0.05）,而且AT56可抑制转染对照敲减病毒的DLBCL细胞的生存活力,但是对敲减PTGDS的DLBCL细胞的活力无明显影响,证实AT56在DLBCL中对PTGDS的特异性抑制作用。AT56可显著抑制DLBCL细胞的增殖水平且抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性。AT56可降低DLBCL细胞中c-myc的表达水平。2.AT56以浓度依赖性的方式诱导DLBCL细胞在G0/G1期阻滞且抑制Cyclin D1及CDK2的表达水平。流式细胞实验结果显示在AT56的作用下,DLBCL细胞的凋亡水平以浓度依赖性的方式显著增高,而且Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved-PARP等促凋亡蛋白的表达水平增高,而Bcl-xl等抗凋亡蛋白的表达水平下降。此外,Transwell结果显示AT56可显著抑制DLBCL细胞的侵袭能力及zeb1和vimentin的表达水平,抑制作用随AT56浓度的升高而增强。研究结果提示AT56在DLBCL细胞中可发挥显著的抗肿瘤作用。3.在异种移植小鼠模型中,接受AT56治疗的小鼠（n=5）肿瘤的生长速度、肿瘤重量及肿瘤体积均较对照组降低,此外,AT56治疗后小鼠的肿瘤组织中Ki67、c-myc和Cyclin D1的表达水平下降,Bax和cleaved PARP的表达水平增高。4.qRT-PCR实验结果显示阿霉素及苯达莫司汀可降低DLBCL细胞中PTGDS的mRNA表达水平。AT56的加入可增强阿霉素及苯达莫司汀对DLBCL细胞增殖及凋亡水平的影响。由于阿霉素及苯达莫司汀通过促进DNA损伤发挥抗肿瘤作用,进一步的彗星实验结果表明,经过AT56处理的DLBCL细胞有更长的尾距,表明DNA损伤水平的增高。此外,Western blotting实验及免疫荧光共聚焦实验表明AT56可促进DLBCL细胞中DNA损伤标志物（p-H2AX）的表达升高。研究结果表明AT56可通过诱导细胞DNA损伤增强DLBCL细胞的药物敏感性。结论:以上研究证实,PTGDS特异性抑制剂AT56可通过抑制细胞的生存和增殖、诱导周期阻滞、促进细胞凋亡、抑制细胞侵袭等在DLBCL中发挥显著抗肿瘤作用,而且AT56可通过增强细胞中DNA损伤促进DLBCL细胞对阿霉素及苯达莫司汀的药物敏感性,研究结果为建立新型DLBCL分子靶向治疗及联合治疗方案提供了理论依据及实验基础。第三部分:糖蛋白PTGDS通过MYH9介导Wnt-β-catenin-STAT3信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的发生发展目的:我们的前期研究结果表明PTGDS在DLBCL中的高表达与患者临床治疗效果及预后显著相关,而且敲减PTGDS及其特异性抑制剂AT56可通过调节DLBCL细胞增殖、周期、凋亡和侵袭等生物学功能而在DLBCL中发挥抗肿瘤作用,但是其深入的分子机制尚不清楚。本研究旨在探讨PTGDS调控DLBCL发生发展的分子机制,阐明糖基化对PTGDS蛋白降解、胞内定位及生物学功能的影响,为PTGDS及AT56在构建DLBCL个体化精准诊疗方案中的应用提供实验基础和理论依据。材料和方法:1.DLBCL细胞培养;2.免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation,CoIP）和质谱检测;3.免疫荧光染色（IF）及共聚焦显微技术;4.慢病毒载体介导MYH9的敲减;5.蛋白提取和蛋白质免疫印迹分析（Western blotting）;6.CellTiter-Glo Luminescent 检测细胞生存活力;7.CCK-8检测DLBCL细胞的增殖水平;8.PI/RNase法检测细胞周期;9.Annexin V-PE/7AAD双染法检测细胞凋亡水平;10.Transwell检测细胞的侵袭能力;11.RNA提取、逆转录和实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）;12.染色质免疫共沉淀技术（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）;13.胞浆胞核蛋白提取;14.统计学分析。结果:1.基于CoIP的质谱检测筛选DLBCL细胞中PTGDS的相互作用蛋白,其中MYH9的评分最高,并通过STRING进行蛋白相互作用分析。基于公共数据库GSE31312的生物信息学分析结果显示PTGDS和MYH9的表达水平存在明显的相关性（p＜0.001）。免疫荧光共聚焦实验和CoIP实验证实了内源性PTGDS和MYH9在DLBCL细胞中的共定位及相互作用。2.慢病毒介导的MYH9敲减在DLBCL细胞中显示出较好的抑制MYH9表达的效果,其中sh-MYH9#1具有最高的敲减效率。MYH9敲减和MYH9抑制剂Blebbistatin可通过抑制细胞增殖和生存活力、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡和抑制细胞侵袭发挥抗淋巴瘤作用。Blebbistatin在敲减MYH9的DLBCL细胞中对细胞增殖、生存活力及细胞周期无明显影响,表明在DLBCL细胞中Blebbistatin对MYH9的特异性抑制作用。3.基于CoIP的质谱检测筛选的PTGDS相互作用蛋白和Wnt信号通路的激活密切相关,体外及体内实验结果表明加入AT56和敲减PTGDS可降低MYH9和STAT3的表达水平,且抑制经典Wnt信号通路的激活。敲减MYH9可以抑制Wnt通路的激活并降低STAT3的表达水平。有趣的是,PTGDS和MYH9的抑制可降低Wnt通路关键分子β-catenin的蛋白表达水平,但不影响其mRNA的表达水平,表明β-catenin蛋白降解的增加。免疫荧光共聚焦实验和CoIP实验证实了内源性MYH9和β-catenin降解复合体中的GSK3-β在DLBCL细胞中的共定位及相互作用。PTGDS和MYH9的敲减可降低GSK3-β的泛素化水平、延长其在DLBCL中的半衰期,从而诱导β-catenin的降解、抑制Wnt信号通路中下游分子的活化。同时,PTGDS和MYH9抑制可降低DLBCL细胞中STAT3的mRNA和蛋白的表达水平,ChIP实验结果表明Wnt通路中的转录因子TCF4和STAT3启动子的相互结合,提示在DLBCL细胞中STAT3是Wnt信号通路的下游分子。4.加入Wnt3a激活Wnt信号通路后,可逆转AT56对DLBCL细胞增殖、周期及凋亡的影响,此外,AT56对Wnt通路中重要分子表达水平的调节作用也可被Wnt3a逆转,表明AT56通过抑制Wnt信号通路的激活发挥抗淋巴瘤作用。Wnt3a无法逆转AT56对MYH9表达的抑制作用,表明在DLBCL细胞中MYH9不位于Wnt信号通路的下游。STAT3抑制剂WP1066可逆转过表达PTGDS引起的增殖水平升高,且增加AT56在DLBCL细胞的增殖抑制和凋亡促进作用,表明STAT3参与PTGDS在DLBCL中的致癌作用。此外,MYH9抑制剂Blebbistatin可逆转过表达PTGDS引起的增殖水平升高和Wnt-β-catenin-STAT3信号通路的激活,表明MYH9介导PTGDS对Wnt-β-catenin-STAT3信号通路及DLBCL发生发展的调控作用。5.基于UniProt数据库,我们发现PTGDS蛋白有3个特异性糖基化位点,包括两个N糖基化位点（Asn51和Asn78）和一个O糖基化位点（Ser29）。使用PNGase F或者加入衣霉素（tunicamycin）去除糖链后可增加低分子量PTGDS蛋白的比例,表明DLBCL中的PTGDS蛋白存在糖基化。而且,衣霉素抑制糖基化后可促进DLBCL细胞中PTGDS蛋白的核易位。相比于正常的CD19+B细胞,PTGDS蛋白在DLBCL中的表达水平升高,但其mRNA表达水平下降,而且Western blotting实验结果显示DLBCL细胞中PTGDS蛋白的糖基化水平低于正常B细胞。在环己酰亚胺追踪实验中,去糖基化可抑制PTGDS蛋白的降解并延长其半衰期,研究结果可部分解释DLBCL中PTGDS蛋白和mRNA表达水平的不一致。6.对DLBCL细胞中PTGDS的两个潜在的N-糖基化位点（Asn51和Asn78）进行点突变,发现糖基化位点突变的PTGDS蛋白比野生型PTGDS蛋白的分子量较低,证实了 DLBCL中的PTGDS的糖基化及其位点。免疫荧光共聚焦实验结果显示糖基化位点突变可促进PTGDS蛋白向细胞核的转移。点突变介导的去糖基化可促进DLBCL细胞增殖并增加c-myc的表达水平。结论:我们的研究结果表明,PTGDS可能通过MYH9介导Wnt-β-catenin-STAT3信号通路促进弥漫大B细胞淋巴瘤的发生发展,而且PTGDS蛋白中Asn51和Asn78的异常糖基化可导致蛋白半衰期延长、胞核转移并增强其促癌作用,揭示了糖蛋白PTGDS参与DLBCL发生发展的分子机制,为构建新型DLBCL精准个体化诊疗方案提供新的生物标志物及分子靶点。