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研究背景及目的胆管癌（Cholangiocarcinoma,CC A）是一种发生于胆管的高度侵袭性肿瘤,按解剖学分类,由肝内型胆管癌（iCCA）、肝门部胆管癌（pCCA）和远端胆管癌（dCCA）三种亚型组成,由于其恶性程度高,预后极差。世界范围内胆管癌的发病率较低,故目前对其研究较少,但亚洲地区尤其中国发病率有上升趋势,且胆管癌由于发病隐匿,常规体检不易发现,故发现多属晚期,根治性手术率低,即使行根治性手术切除,术后5年生存率不足30%。目前,已有研究报道了胆管癌相关的基因突变谱,Smad4是发生突变率较高的基因之一。我们的病例资料测序结果也有类似的发现,故我们把Smad4作为我们的研究对象,本研究旨在探讨Smad4在胆管癌中的表达情况及预后意义,并深入探讨Smad4在胆管癌发生发展中的作用及可能的作用机制。2020年Pemigatinib被美国FDA批准用于治疗FGFR2基因融合/重排的晚期胆管癌,也是目前唯一获批的胆管癌靶向药物,那么Smad4突变是否影响Pemigatinib的治疗效果,也是我们感兴趣的研究内容。研究方法1.研究胆管癌中Smad4的表达和预后的关系1.1对胆管癌组织标本进行二代测序（NGS）,研究CCA常见基因突变情况。1.2在胆管癌组织中检测Smad4的表达（RNA和蛋白质水平）1.3按Smad4的表达高低分组,研究不同类型胆管癌中Smad4表达与患者生存预后的关系。分别将Smad4在iCCA,pCCA和dCCA中的表达分为高表达组和低表达组,研究Smad4表达与肿瘤患者生存时间和预后的关系。1.4构建Smad4的稳转胆管癌细胞系,通过敲低及过表达Smad4,在体内外实验中进一步证实Smad4对胆管癌的作用。用胆管癌细胞系QBC939和RBE建立Smad4敲低和过表达的病毒转染细胞系,体外通过CCK8细胞增殖实验、Transwell细胞侵袭和转移实验,体内通过裸鼠皮下成瘤实验研究Smad4对胆管癌增殖侵袭转移的影响。2.胆管癌中Smad4的表达与β-catenin的关系2.1胆管癌中Smad4与β-catenin表达量及细胞内分布的关系。通过westernblot和qPCR研究Smad4与β-catenin在蛋白质及RNA水平的表达关系,通过免疫荧光显示Smad4与β-catenin在细胞内的定位关系。2.2 胆管癌组织芯片行组化评分,分析Smad4与β-catenin核浆表达的关系。2.3 探讨胆管癌中Smad4与Wnt通路活性的关系。应用双荧光素酶报告基因研究Smad4对Wnt通路活性的影响。3.Smad4调控β-catenin核转位的机制3.1 胆管癌中β-catenin-S675位点磷酸化是β-catenin核转位必需的3.1.1 应用westernblot研究胆管癌中β-catenin不同位点的磷酸化水平,免疫荧光研究S675位点磷酸化与β-catenin胞内分布的关系。3.1.2 通过免疫共沉淀发现Smad4与PAK1及β-catenin相互作用,westernblot证实PAK1与S675位点磷酸化的关系。3.1.3 体内外实验研究S675位点磷酸化水平对胆管癌增殖、侵袭的影响。3.2 Smad4调控PAK1去磷酸化的机制3.2.1 从胆管癌细胞中免疫沉淀Smad4,并进行LC-MS/MS筛选与Smad4相互作用的蛋白。通过质谱分析发现与Smad4相互作用的蛋白PP1A。3.2.2 通过免疫共沉淀及westernblot研究Smad4和PP1A与PAK1磷酸化水平的关系。免疫荧光进一步证实PP1A与PAK1的细胞内定位关系。3.2.3 体外实验证实PP1A对胆管癌增殖、侵袭及转移的影响。3.3 Smad4调控PP1A发挥磷酸化作用的机制3.3.1 在LC-MS/MS中对蛋白质序列进一步进行筛选,发现能与PP1A特异性结合的蛋白质。通过westernblot研究MYO18A与PAK1及β-catenin磷酸化水平的关系。3.3.2 采用基因编辑技术,把MYO18A基因截短,通过免疫共沉淀研究MYO18A与Smad4及PP1A相互作用位点及对PAK1和β-catenin-S675磷酸化的影响3.3.3 通过免疫荧光研究MYO18A、PP1A与Smad4的细胞定位关系。3.3.4 研究MYO18A对胆管癌增殖、迁移和侵袭的影响以及在胆管癌组织中的表达情况,行预后分析。4.探索Smad4与FGF2诱导的胆管癌关系。4.1 Smad4对于FGF2诱导的胆管癌的生物学特性的影响。通过CCK8、Transwell及小鼠皮下移植瘤及肺转移瘤模型研究Smad4对FGF2诱导的胆管癌增殖、迁移和侵袭的影响。4.2 FGFR2抑制剂抑制β-catenin-S675磷酸化,从而在胆管癌中发挥抑癌作用。体内外实验研究Smad4是否通过PP1A发挥协同作用。4.3 在临床肿瘤组织芯片标本中,分析β-catenin-S675磷酸化水平、Smad4和FGFR2之间的相关性。研究结果本研究中,我们对15个pCCAs和16个dCCAs进行了二代测序（NGS）,并在261个胆管癌组织中检测了 Smad4（一种经常突变的基因）的表达。通过单变量和多变量分析,我们确定Smad4在iCCA和pCCA中是一个有利的预后生物标志物。通过体外和体内实验,我们证明Smad4通过抑制β-catenin-s675磷酸化和核内转位来抑制胆管癌的增殖、迁移和侵袭。我们利用LC-MS/MS和多种生化技术鉴定PP1A是Smad4介导的PAK1-T423去磷酸化的磷酸酶,而PAK1-T423 调控 β-catenin-s675 的磷酸化。此外,我们还证明了 MYO18A是PP1A在胆管癌中识别底物的pp1相互作用蛋白。MYO18A通过其RVFFR基序与PP1A相互作用,通过CC结构域与Smad4相互作用。MYO18 A和Smad4共表达的患者预后优于其他患者。Smad4增强Pemigatinib对胆管癌的抑制作用,而敲低Smad4将导致Pemigatinib的耐药性。研究结论Smad4和 MYO18A的共表达是iCCA和pCCA的良好预后指标。Smad4-MYO18A-PP1A 复合物使 PAK1-T423 脱磷酸化,从而抑制β-catenin-S675磷酸化及其核内移位。Smad4通过调控β-catenin的磷酸化和细胞内定位,抑制胆管癌的增殖、迁移、侵袭和对Pemigatinib的敏感性。