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研究背景: 现代社会老龄化程度越来越高，根据第六次全国人口普查资料推算，平均每年新增800万左右的65岁及以上老年人口。随着老龄人口急剧增加，伴随而来的口腔问题也在随之增多，特别是牙列缺损。现有的修复方式主要包括可摘局部义齿修复、固定义齿修复、种植义齿修复。以上修复方式各有优点，但同时存在诸多不足，如咀嚼效率低、美观性差、邻牙损伤严重、价格高昂等。组织工程化牙齿一直是口腔修复的研究方向，它将解决现有修复方式的各项不足，使我们对缺失牙的修复更加完美。颅神经嵴来源的外胚间充质干细胞（ectomesenchymal stem cells,EMSCs），可以与牙源性上皮相互作用形成牙乳头和牙囊，进一步分化发育成牙本质、牙骨质、牙髓等组织结构，被认为是牙齿发育中的始祖细胞。据体外研究表明，颅神经嵴来源的EMSCs具有较强的自我复制能力和多向分化潜能，说明将EMSCs作为组织工程化牙齿的种子细胞具有良好的应用前景。 p75NTR（p75 neurotrophin receptor）是一种低亲和力神经营养因子受体，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。在早期胚胎发育过程中，广泛参与多种组织的发生发育。牙齿的发育过程始终伴随上皮-间充质相互作用，而细胞在体外不同的融合状态表现出各异的细胞生物学特征。课题组前期研究发现：在SD大鼠胚胎11.5天时颅神经嵴来源细胞迁移向颌突组织，并且在胚胎12.5天时SD大鼠的牙齿发育并未启动。本研究着重探讨SD大鼠在胚胎12.5天时，EMSCs在不同融合状态下对p75NTR的表达影响以及对EMSCs矿化能力的影响，为下一步研究细胞间相互作用是如何促进EMSCs矿化分化打下实验基础，同时为后期矿化实验研究如何选择最佳细胞融合条件提供实验依据。 研究内容: 1、SD大鼠E12.5d颌突组织EMSCs的体外获取、培养及鉴定 取孕12.5 d SD大鼠，行2%戊巴比妥钠腹腔注射（40mg/ kg），约10min麻醉起效后脱颈处死孕鼠，无菌手术间取出鼠胎，手术刀切取胎鼠颌突组织，并切成约0.1mm3大小的细小组织块，胰蛋白酶37℃消化 5min，800r/min离心5min，弃上清，100目不锈钢筛网过滤，加入含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12 培养基，置于5%CO2 37℃细胞孵 育箱中进行培养。传代培养至第三代，流式细胞术检测培养细胞表面抗原，明确细胞来源、性质。 2、构建EMSCs的4种融合状态，对比研究4种融合状态EMSCs 中p75NTR 表达差异 取第3代SD大鼠E12.5d EMSCs以不同细胞密度进行铺板：半融合状态（1.0× 104个/cm2）、融合前状态（1.5×104个/cm2）、融合状态（2.5×104个/cm2）、融合后状态（3.5×104个/cm2），贴壁后即对应获得4种融合状态EMSCs，铺板24小时后用于下一步实验。在矿化诱导0、3、7d时提取4种融合状态EMSCs总RNA和总蛋白样本，检测p75NTR的mRNA和蛋白的表达水平。 3、对比研究4种融合状态EMSCs的矿化能力 取第3代EMSCs按上述方法铺板获取4种融合状态EMSCs并进行矿化诱导培养，在矿化诱导0、3、7d时提取4种融合状态EMSCs总RNA和总蛋白样本，检测矿化相关基因Runx2、Col1、ALP的mRNA表达水平和Runx2、Col1的蛋白表达水平。于矿化诱导14、21d后检测4种融合状态EMSCs ALP活性、钙盐沉积能力。 结果: 1、通过流式细胞术检测体外分离培养的第三代SD大鼠E12.5d EMSCs细胞表面抗原，CD29、CD90、CD146、p75NTR表达阳性率分别为95.14%、97.61%、96.10%、26.39%，CD45表达0.01%。CD29、CD90、CD146表达阳性，CD45表达阴性，以上检测结果表明本实验细胞为间充质来源的干细胞。 2、（1）在矿化诱导0天时，融合状态组的p75NTR在mRNA水平和蛋白水平表达均较其他三组更高，差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）在矿化诱导 3、7d后，同样是融合状态组的p75NTR表达最高（P＜0.05）。 3、（1）矿化诱导0天时，Runx2、Col1、ALP在mRNA水平和Runx2、Col1在蛋白水平表达无明显差异。在矿化诱导3、7d时，Runx2、Col1、ALP在mRNA水平和 Runx2、Col1 在蛋白水平表达均是在融合状态组表达最高，差异有统计学意义（P＜0.01）。（2）碱性磷酸酶染色结果：矿化诱导14d后，融合状态组细胞染色最深，融合前状态组和融合后状态组染色程度接近，较融合状态组染色浅，半融合状态组染色最浅。(3)茜素红染色结果：矿化诱导 21 天后，茜素红染色检测 4 种融合状态细胞钙盐沉积量，其结果与ALP染色结果趋势一致：即融合状态组钙盐沉积量最多，细胞矿化程度最高（P＜0.01）。 结论: 综上所述，本研究通过探讨SD大鼠E12.5d EMSCs在4种融合状态时p75NTR的表达差异以及对EMSCs体外矿化的影响，发现在融合状态时细胞间的相互作用可以促进p75NTR表达；矿化诱导3、7d后，矿化相关基因的mRNA和蛋白检测结果显示融合状态组细胞较其他3组细胞矿化能力更强；矿化诱导14d后，ALP染色显示融合状态组细胞染色最深，提示融合状态组ALP活性最强；矿化诱导21d后，钙盐沉积检测显示在融合状态组矿化能力较其他3组更强，矿化程度更高。以上结果表明：EMSCs在不同融合状态时p75NTR的表达及细胞矿化能力有明显差异，这些差异与初始细胞密度相关。因此我们推测：在不同融合状态下，p75NTR的表达差异以及EMSCs矿化能力的差异，可能与细胞间相互作用的差异有关。但细胞间的相互作用是如何促进EMSCs的矿化能力还需要进一步研究。