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[研究背景]喉癌是最常见的头颈部恶性肿瘤之一,具有易发生淋巴结转移和致死率较高的特点,严重危害了人们的健康。当前喉癌的治疗,虽然采用了手术切除、激光、放疗化疗等多种疗法联合的方式,但是喉癌的生存期并未取得较好的改善。现已明确,侵袭和转移是喉癌治疗失败的重要原因,而上皮间质转化（epithelia mesenchymal transition,EMT）又是肿瘤发生转移和侵袭的重要机制,目前介导喉癌EMT机制尚不明确,因此,开展介导喉癌EMT机制的研究对挖掘喉癌治疗策略具有重要的临床意义。微小RNA（microRNA,miRNA）是一类长度仅有18-25个核苷酸的RNA序列,本身并不直接编码蛋白质,其主要功能是通过调控靶基因mRNA的转录过程来影响生物体内多种生理与病理过程。近年来,我们发现多种肿瘤的发生发展过程中伴随着miRNA表达谱的紊乱的现象,且部分miRNA可以通过相应的靶基因的信号通路调控肿瘤细胞的增殖、迁移和转移等多种生物学行为,因而miRNA也已成为肿瘤学新的研究方向。研究表明miR-34a-3p在多种肿瘤组织或细胞中呈现出低表达的状态,且通过外源性增加或促进miR-34a-3p的表达能够抑制多种肿瘤的增殖生长,而其对喉癌细胞相关恶性生物学行为的作用和机制尚待阐明。[研究目的]探讨miR-34a-3p对喉癌增殖、迁移及侵袭转移等恶性生物学行为的作用并揭示其作用机制。[材料与方法]1.喉癌组织、癌旁组织以及正常组织收集:收集自2018年6月至2020年1月间于我院耳鼻喉头颈外科行手术切除或病理活检的喉癌患者33例,及10例正常患者喉部组织,统计入选患者的临床病理信息。实验所用雄性Babl/c裸鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司。2.生物信息学:利用TCGA和GEO等数据库分析miR-34a-3p在喉癌中的表达。3.RT-PCR:分析miR-34a-3p在喉癌组织、癌旁组织以及正常组织中的表达差异,并分析miR-34a-3p与喉癌患者临床病理学特征的相关性。4.TU686和AMC-HN-8两种喉癌细胞转染后均分别采用CCK-8、克隆形成实验,检测miR-34a-3p对两种喉癌细胞增殖生长的影响;划痕实验、Transwell小室实验考察miR-34a-3p对TU686和AMC-HN-8两种喉癌细胞迁移和侵袭的影响;RT-PCR和Western Blot 检测 miR-34a-3p 对TU686 喉癌细胞 AXL 以及 PI3K/Akt/Snail-EMT 相关信号通路中蛋白的影响。5.利用双荧光素酶报告基因系统、RT-PCR、Western Blot及免疫组化验证miR-34a-3p的靶基因。6.TU686喉癌细胞裸鼠移植瘤和裸鼠尾静脉肺转移模型实验验证miR-34a-3p mimic对喉癌细胞体内生长和转移的作用。[实验结果]1.利用TCGA和GEO数据库分析结果显示,miR-34a-3p在喉癌组织中表达水平显著低于正常组织。采用Kaplan-Meier进行生存分析,结果显示喉癌患者中miR-34a-3p低表达,其总生存期明显低于高表达患者。2.RT-PCR结果显示,我院临床33例喉癌患者喉癌组织中miR-34a-3p的表达水平明显低于癌旁组织和正常组织。男性喉癌患者组织中miR-34a-3p表达水平与女性喉癌患者组织中miR-34a-3p的表达水平没有明显差异;年龄大于60岁的喉癌患者组织中miR-34a-3p表达水平与年龄小于60岁喉癌患者组织中miR-34a-3p的表达水平没有明显差异;出现淋巴结转移的喉癌患者组织中的miR-34a-3p表达水平低于未出现淋巴结转移的患者组织中的miR-34a-3p表达水平;T3+T4喉癌患者组织中的miR-34a-3p表达水平低于T1+T2患者组织中的miR-34a-3p表达水平;Ⅲ+Ⅳ期喉癌患者组织中的miR-34a-3p表达水平低于Ⅰ+Ⅱ患者组织中的miR-34a-3p表达水平。3.CCK-8、克隆形成结果显示,转染miR-34a-3p的TU686和AMC-HN-8两种喉癌细胞增殖和克隆生成能力明显降低;细胞划痕实验和Transwell实验结果显示,转染miR-34a-3p的TU686和AMC-HN-8两种喉癌细胞伤口愈合度显著减少,侵袭细胞数显著减少。4.RT-PCR及Western Blot结果显示,转染miR-34a-3p能够显著抑制TU686细胞内 PI3K/Akt/Snail-EMT 相关信号通路中 N-cadherin、Vimentin 和 Snail 基因 mRNA和蛋白的表达以及能够抑制PI3K和Akt蛋白磷酸化激活,同时能够升高E-cadherin的mRNA和蛋白表达。5.双荧光素酶报告基因系统结果显示,当报告基因载体含有AXL 3’-UTR序列与miR-34a-3p mimic共同转染293T细胞时,细胞荧光素酶相对活性较mimic control组显著降低;RT-PCR 和 Western Blot 结果显示 miR-34a-3p mimic 组 AXL 基因 mRNA和蛋白表达明显降低。6.体内裸鼠移植瘤和裸鼠肺转移模型结果显示,miR-34a-3p mimic组TU686移植瘤大小低于mimic control组,miR-34a-3p mimic组TU686喉癌细胞肺转移结节数显著少于mimiccontrol组。[结论]1.miRNA-34a-3p在喉癌组织中低表达,且低表达miR-34a-3p的喉癌恶性程度高。2.miR-34a-3p在喉癌组织中表达水平与喉癌是否发生转移、喉癌TNM分级以及临床分析呈现负相关,而与患者的性别及年龄没有关系。3.miR-34a-3p能够在体内外抑制TU686和AMC-HN-8两种喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭。4.miR-34a-3p抑制喉癌迁移、侵袭的作用机制是通过靶向AXL调控PI3K/Akt/Snail-EMT信号通路而实现的。