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氟中毒是全世界广泛存在的一种人畜共患性地方病,由于其化学性质活泼,安全范围极窄,稍有过量就会引起毒性作用,流行病学调查和实验室研究均证实了氟的雄性生殖毒性。本课题组依照已有报道,结合前期实验结果和测序分析,提出IL-17信号通路可能是氟中毒动物睾丸免疫应答反应的中心环节。因此,本项目选取动物睾丸为研究对象,通过构建氟中毒动物模型、IL-17A基因敲除和IL-17A功能加强模型,检测氟对睾丸的损伤过程、IL-17A及其信号通路的变化、以及睾丸IL-17A功能改变对氟中毒动物睾丸损伤的影响,深入分析IL-17A及其信号通路是否参与调控了氟中毒动物睾丸的损伤的反应过程,从而进一步揭示氟的生殖毒性机理,也为人类相关健康问题提供动物模型与实验依据。1.通过利用CRISPR/Cas9途径建立IL-17A基因敲除小鼠模型,对C57BL/6J小鼠进行IL-17A基因的全身性敲除。经过对F0及F1代小鼠繁育和基因型鉴定后,成功得到了数只雄性IL-17A基因敲除小鼠。2.在50 mg/L的NaF暴露90天后的小鼠睾丸中,IL-17A、IL-17R、IL-23和IL-1βm RNA的表达量显著升高,通过免疫组化实验检测发现IL-17A和IL-17R主要存在于睾丸的间质中,继而通过对睾丸间质液中IL-17A含量的测定发现,随着NaF浓度的升高IL-17A的含量也随之升高。3.对小鼠50 mg/L NaF处理90天后,雄性小鼠骨骼和睾丸中的氟含量有明显的上升且小鼠体增重明显降低。与对照组相比,在50 mg/L NaF组小鼠组织切片中发现睾丸的生精细胞和精子均明显减少,且生精小管间距增大,这些损伤在IL-17A功能增强后更为严重,可观察到管间水肿和Leydig细胞空泡化,然而将小鼠的IL-17A基因敲除之后,该类小鼠的体增重和睾丸组织形态与正常小鼠相比未见明显的改变。4.通过透射电镜的观察发现,50 mg/L NaF暴露下的小鼠睾丸中Leydig细胞的脂滴变大,数量减小,说明睾酮分泌功能下降,且边缘绒毛消失,内质网减少。50 mg/L NaF暴露下的IL-17A敲除组小鼠的睾丸结构正常,未见明显病变。5.在50 mg/L NaF的暴露下和IL-17A功能增强可使小鼠精子的数量显著降低,并且精子的畸形率增加,但是将IL-17A敲除之后,试验小鼠的精子数量和畸形率与对照组相比没有统计学上的差异。6.50 mg/L NaF暴露下可使小鼠睾丸中IL-17A和IL-1β的蛋白水平含量显著升高且IL-17RC和IL-23的含量极显著升高,而IL-17RA的含量没有显著变化。IL-17A功能增强后小鼠睾丸中IL-17A的含量显著升高,IL-17RC的含量极显著升高,但是IL-17RA和IL-23的含量没有显著变化。此外,与对照组相比,于IL-17A敲除组小鼠睾丸内的各炎症因子的变化没有显著的变化。7.在氟中毒小鼠睾丸间质中的各类细胞中,IL-17A+细胞主要为γδT细胞;用抗TCR和抗IL-17A标记γδT细胞,发现F暴露组荧光强度增加;用Ed U标记γδT细胞,发现在50 mg/L NaF组中,小鼠睾丸中γδT细胞发生明显增殖。这证明了在F中毒小鼠睾丸中IL-17A的主要来源为γδT细胞。8.在体外试验中,通过对Leydig细胞的培养发现,2 mg/L的NaF和1 ng/L的IL-17A可明显地降低Leydig细胞分泌睾酮的能力,并诱导其凋亡。此外,该剂量的NaF和IL-17A还可使睾酮分泌相关基因3β-HSD、CYP11a和17β-HSD的表达量发生显著的下降。9.小鼠在50 mg/LNaF的暴露下和IL-17A的功能增强的情况下,小鼠睾丸中IL-17A、IL-17R、IKB、ACT1、CEBPb和TRAF6蛋白的表达量升高,并可导致ARK1C3、SHD和CYP11A1的蛋白表达量降低。但是将IL-17A基因敲除之后,小鼠睾丸中的这些蛋白的表达量与对照组相比没有统计学上地差异。以上实验结果证明在氟中毒的小鼠睾丸中,氟确实激活了IL-17A信号通路,这可能是氟致睾丸损伤的机制之一。10.利用野生型和IL-17A基因敲除小鼠F中毒（50 mg/L NaF）模型作为研究对象,通过高通量测序对小鼠的睾丸进行了miRNA测序。经过对差异miRNA和其靶基因的筛选及分析后发现,IL-17A功能改变后主要影响了F中毒小鼠睾丸中细胞凋亡通路,特别是线粒体凋亡通路。11.利用野生型和IL-17A基因敲除小鼠F中毒（50 mg/L NaF）模型作为研究对象,通过高通量测序对小鼠的睾丸进行了miRNA测序。结果发现,同样为F中毒小鼠,当将IL-17A敲除之后,引起了诸多分子信号通路的转导的变化,但是JAK-STAT信号通路的富集程度很高,结果可靠,提示JAK-STAT信号通路可能参与了IL-17A功能改变对氟中毒小鼠睾丸损伤的过程。综上结论,IL-17A及其信号通路参与了氟中毒动物睾丸损伤的调节;IL-17A基因敲除后可缓解氟对小鼠睾丸的损伤;氟中毒小鼠睾丸中IL-17A主要来源于γδT细胞;氟和IL-17A可降低小鼠睾酮的分泌能力并可促进Leydig细胞的凋亡。线粒体凋亡通路和JAK-STAT信号通路参与了IL-17A功能改变后氟致小鼠睾丸的损伤过程。