细菌的群体感应系统中,自诱导物通常并非常见的代谢中间产物,而是自身分泌的特定小分子物质。硫化氢(H2S)作为微生物产生的一种内源性小分子物质,具有自由跨膜的特性。大肠杆菌释放的H2S主要由3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)途径产生。以大肠杆菌为研究对象,我们发现作为第三类气体信号分子的H2S与菌体密度线性相关,而与大肠杆菌的种类、培养基类型以及培养基pH值无关。从动态调控工程的角度,H2S符合群体感应信号分子的特征,于是我们设计并构建了基于H2S信号分子的群体感应型基因回路。动态调控基因回路涉及几个关键元件:信号转换器-信号感受器-启动器。硫醌氧化还原酶(SQR)是定位于质膜内侧的一种硫氧化蛋白,其功能是氧化H2S生成硫烷硫(HSnH,n>2),相比于H2S的自由穿膜,生成的HSnH会保存于胞内,因此SQR可以充当信号转换器的角色,将胞外H2S信号转换成胞内HSnH信号。由于大肠杆菌自身并不含有SQR,故将PpSQR和CpSQR分别在大肠杆菌中异源表达并检测其功能。结果显示二者都可以在大肠杆菌中正常发挥作用,但酶活具有差异显著。目前研究发现自然界存在多个能特异性感应硫烷硫的转录调控因子,我们选择FisR、CstR和BigR为研究对象,验证其受HSnH诱导的特异性,结果显示在大肠杆菌中只有CstR特异性感应硫烷硫。因此我们选择CstR作为信号感受器元件。至于启动器,我们通过组合不同的启动子和操纵子,得到了多个不同强度的启动器,具有对菌体密度不同的响应灵敏性。将构建好的基因回路应用于细胞工厂,成功实现了菌体由生长阶段到发酵阶段的自动过渡,以木糖酸发酵生产为例,实现了 9.68g/L的产量(10g/L木糖)。为进一步提高启动器的强度,我们引入了 T7 RNA聚合酶和T7启动子,构建了双层基因回路:第一层,以H2S为信号分子的群体感应型基因回路依据菌体密度的变化控制T7 RNA聚合酶的表达;第二层,由T7RNA聚合酶开启T7启动子的表达。实验结果显示,与IPTG诱导相比,双层基因回路具有蛋白表达量高和自诱导的优势。至此,全部基因回路的设计和构建都是以质粒作为平台进行的,考虑到质粒载体容量和转化效率的影响,我们决定直接改造大肠杆菌的基因组:将基因回路中的感应器(cstR基因)和启动器元件通过基因重组的方法构建到E.coli BL21(DE3)基因组中,成功构建了两株稳定的重组菌株BL21(CstR-DE3)。随后逐步优化配套表达质粒PET30,使之与重组菌株相适配。新的蛋白表达系统继承了先前双层基因回路的优点。综上所述,本文的研究工作围绕H2S具有群体感应信号分子的特点而展开,构建了一系列不同感应强度和不同灵敏度的群体感应型基因回路,实现了生产发酵过程中大肠杆菌由生产阶段到产物合成阶段的自动化切换,从细胞工厂角度来看,具有很好的生产效益和应用价值,为合成生物学和动态代谢工程的研究提供了新的研究工具。