微生态制剂(Microbial ecological agent)作为抗生素的替代品之一被广泛应用于凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的养殖过程中。微生态制剂不仅能解决抗生素药物残留对养殖动物以及人类的潜在危害,而且活的益生菌通过调节微生物群落结构,控制致病菌的数量,增加益生菌的数量,起到防治病害的作用。但是,微生态制剂中耐药菌的存在同样会对水产养殖动物以及人类健康造成潜在威胁,研究常见商业水产用微生态制剂的耐药性以及耐药益生菌对对虾肠道和养殖水体微生物群落结构的影响,对指导健康微生态制剂的生产具有重要意义。本论文共分为四个部分:1.微生态制剂中耐药菌株的分离鉴定对市场上购买的3个厂家的三大类(芽孢杆菌、肠球菌和乳杆菌)共计9种微生态制剂采用琼脂稀释法筛选耐药菌株。结果表明,9种微生态制剂中都分离到了耐药菌株,耐药菌株共计100株。100株分离菌株中芽孢杆菌属种类最多,为57株,其次为肠球菌属,为23株。100株分离菌株中仅有44株在我国农业部2013年规定的饲用微生物菌种名单之内。此外还分离到15株致病菌株,致病菌株所占比例为15%。表明市场销售的水产用微生态制剂益生菌产品可能存在安全隐患。2.耐药微生态制剂耐药表型及基因型检测采用药敏实验检测分离菌株对庆大霉素、恩诺沙星、诺氟沙星、氟苯尼考、磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、四环素、土霉素、万古霉素的耐药性,并采用聚合酶链式反应检测耐药菌株中耐药基因(氨基糖苷类、氟喹诺酮类、酰胺醇类、磺胺类、四环素类和糖肽类)和可移动遗传元件。结果表明,100株分离菌株对除恩诺沙星以外的8种抗生素都存在不同程度的耐药表型,其中氟苯尼考的耐药率最高,为100%,磺胺类耐药率也较高为99%;分离菌株中有46%的菌株同时携带六大类抗生素抗性基因,且有15株菌同时携带4种可移动遗传元件,携带两种及两种以上可移动遗传元件的比例为95%。表明微生态制剂耐药益生菌中的耐药基因存在传播转移的可能。3.耐药微生态制剂对凡纳滨对虾肠道微生物菌群的影响从分离菌株中筛选得到一株Tn916转座子上含有tetM耐药基因和质粒上携带tetM、tetA、ant(3’)-Ia(aadA)耐药基因的枯草芽孢杆菌。将枯草芽孢杆菌以10~8CFU/g饲料的含量投喂凡纳滨对虾,不同投喂时间下采用高通量测序技术检测对虾肠道微生物群落结构的变化,同时采用qPCR技术检测耐药基因丰度的变化。结果表明,投喂枯草芽孢杆菌后14d微生物群落结构变化不大,21d明显提高了对虾肠道菌群的丰度和多样性。在优势菌的分类上,不同取样时间点的加菌组和对照组中都以变形菌门(Proteobacteria)为主要类群。此外,作为变形菌门的两类益生根瘤菌,贪铜菌属(Cupriavidus)在投喂菌剂后期的含量要明显小于投喂前期,伯克霍尔德杆菌属(Burkholderia)在不同的取样点均表现为加菌组含量小于空白对照组。致病性弧菌科(Vibrionaceae)也是主要的类群,并且在连续投喂菌剂的第42d对虾肠道中弧菌属(Vibrio)和发光杆菌属(Photobacteriumr)相对丰度明显大于对照组。qPCR方法检测到tetM耐药基因在14d加菌组中相对丰度要大于对照组,经相关性分析发现,tetM耐药基因的相对丰度与丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)和布鲁氏菌科(Brucellaceae)的数量具有正相关性。该枯草芽孢杆菌的投喂使凡纳滨对虾肠道致病菌增多、益生菌减少、耐药基因丰度增大的现象应引起重视。4.耐药微生态制剂对凡纳滨对虾养殖水体微生物菌群的影响将从分离菌株中筛选获得的一株Tn916转座子上含有tetM耐药基因、质粒上携带tetM、tetA、ant(3’)-Ia(aadA)耐药基因的枯草芽孢杆菌,以10~8CFU/g饲料的剂量投喂给凡纳滨对虾,不同投喂时间下采用高通量测序技术检测对虾养殖水体微生物群落结构的变化,同时采用qPCR技术检测耐药基因丰度的变化。结果表明,投喂枯草芽孢杆菌后的14d、21d和42d都明显增大了对虾养殖水体微生物的丰富度和多样性,54d时菌群的多样性大于对照组但丰富度略小于对照组。投喂枯草芽孢杆菌后14d和21d微生物群落结构相似,但与空白对照组存在明显差异,42d与54d群落结构相似,但与养殖前期存在差异,54d加菌组与空白组趋于相似。在优势菌的分类上,α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)在各取样时间点的加菌组和对照组中均丰度最高,且α-变形菌纲中益生红杆菌科(Rhodobacteraceae)相对丰度最大,红杆菌科的数量随着菌剂的连续投喂逐渐增大。黄杆菌科(Flavobacteriaceae)和交替单胞菌科(Alteromonadaceae)同样为水体中的两类益生菌,两者的含量随着菌剂的连续投喂逐渐降低。耐药基因定量分析结果表明,加菌组tetM耐药基因的相对丰度在不同取样时间点均大于对照组;tetA和ant(3’)-Ia(aadA)耐药基因的相对丰度在14d和21d均表现为加菌组大于对照组,而42d和54d小于对照组。相关性分析未发现与耐药基因变化趋势正相关的菌群,加菌组中耐药基因丰度增大可能与耐药基因的转移有关。该枯草芽孢杆菌的投喂使凡纳滨对虾养殖水体部分益生菌相对丰度降低、耐药基因丰度升高的现象提示相关部门应加强对微生态制剂产品的质量检测,避免微生态制剂的潜在危害。水产用微生态制剂中存在含有耐药基因和可移动遗传元件的益生菌,耐药益生菌的存在可能会增大养殖环境中耐药基因的数量,同时微生态制剂中致病菌的存在可能会使养殖动物以及人类患病。可移动遗传元件上含有耐药基因的枯草芽孢杆菌会降低凡纳滨对虾肠道微生物群落结构的丰富度和多样性、提高对虾养殖水体微生物群落结构的丰富度和多样性,同时含有耐药基因和可移动遗传元件的益生菌可能通过影响微生物群落结构或者通过耐药基因转移来增大对虾肠道和养殖水体耐药基因的丰度。