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目的
多药耐药菌感染是临床抗感染治疗中极为棘手的难题，也是造成重症感染患者死亡的首因，因此，寻找有效控制耐药菌感染的新策略和新药物迫在眉睫。反义抗菌是一种具有全新作用模式的抗菌策略，以与细菌致病性、生存及耐药性相关的关键基因为靶点，利用人工合成的寡核苷酸分子阻断靶基因的表达，抑制靶基因的转录、翻译，达到降低细菌毒力、杀灭细菌或逆转细菌耐药性的目的。与经典抗生素相比，反义抗菌药物具有靶标明确、设计简单、制备工艺成熟等突出优势，已成为对抗耐药菌感染最具前景的方式。然而目前尚未有进入临床研究阶段的反义抗菌药物，制约其发展的最主要困难是裸的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)难以穿透细菌胞膜进入细菌胞内发挥抗菌作用。这主要是因为ASOs分子量大、亲水性强、且多带负电荷的缘故。因此，在当前反义抗菌药物研究领域，需要解决将ASOs高效安全递送入细菌内的问题。
透膜肽-ASOs共价偶联是目前研究最为广泛的反义抗菌寡核苷酸递送方式，但该方式载药量低，合成成本高，仅适用于中性ASOs，且可能存在潜在的免疫原性，故目前仅限于实验室研究中。DNA纳米材料作为一种全新载体材料，是根据碱基互补配对原则，由多条DNA单链在一定条件下自组装形成的不同空间结构。其中DNA四面体(DNA tetrahedron, Td)是由四条或更多DNA单链组装成的四面体结构，合成简单、尺寸参数灵活可控、结构刚性强、修饰位点丰富且生物相容性好，受到广泛关注，研究也较为全面。业已证实，Td可携带小分子化合物(例如多柔比星、放射菌素D等与DNA具有亲和力的药物)或ASOs进入真核细胞，是一类极具应用前景的药物递送载体。
然而Td能否携带ASOs进入细菌，相关研究的文献极为匮乏。为了探讨Td能否作为ASOs的递送载体应用于细菌，需要阐明以下问题：①Td结构是否稳定？影响其制备和保存的因素有哪些？②Td可否被不同种属的细菌高效摄取？摄取具有哪些特征？③Td与ASOs如何偶联？其偶联方式是否影响ASOs在细菌内的抗菌活性？针对上述疑问，本课题首先探究了Td的制备及保存条件，随后以大肠杆菌(E. coli)，金黄色葡萄球菌(S. aureus )，福氏志贺菌(S. flexneri )，肺炎克雷伯杆菌(K. pneumoniae)，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，鲍曼不动杆菌(A. baumannii)为代表，探究不同菌株对Td的摄取特征，以gfp(编码绿色荧光蛋白，greenfluorescentprotein,GFP)和acpP(编码酰基载体蛋白，acylcarrierprotein,Acp)为靶点，设计ASOs分子，探究Td递送ASOs入菌的可能性，并探究Td与ASOs的偶联方式对ASOs靶基因抑制作用的影响，旨在探讨Td作为反义抗菌寡核苷酸递送载体的可行性，为反义小核酸抗菌药物的研发探索新路径、提供新思路。
方法
1.Td的制备、表征与保存
在含有不同Mg2+浓度(0.05、0.5、2、5、10、25、50 mM)的缓冲液中制备不同浓度的Td(1、2、5、10、20μM)，分别利用琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜、激光粒度分析仪进行结构鉴定与表征；通过电泳条带灰度扫描法计算Td产率。将不同条件下成功制备的Td经过冻融或冻干的处理后，鉴定其结构，探究两种保存方式中各因素(Td浓度，Mg2+浓度以及复溶溶剂等)对Td结构的影响。
2.细菌对Td的摄取研究
将前述不同种属的细菌(E. coli, S. aureus, S. flexneri, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii)与Td(FAM标记)共孵育1.5h后，先用DNase处理细菌(500U/mL，37℃，15min)以降解菌膜上可能存在的Td，然后利用流式细胞术与激光共聚焦显微镜检测细菌的阳性率。为进一步提高细菌对Td的摄取率，首先定量评价Lipofectamine2000(LP2000)对E.coli与S.aureus的毒性作用，随后在无毒剂量范围内，将Td与不同比例(0.0025、0.0125、0.025、0.125μL/μgTd)的LP2000混合，制备LP-Td纳米复合物，与E.coli与S.aureus共孵育后，利用流式细胞术检测细菌阳性率，并观察LP-Td浓度、孵育时间及温度对细菌摄取LP-Td的影响。
3.基于Td递送系统的设计及递送效率研究
为了探索Td递送ASOs入菌的可能性以及ASOs与Td的偶联方式对递送效率和基因抑制效果的影响，我们将抗绿色荧光蛋白基因的ASOs(anti-gfp)以环状结构突出于Td一边(Loop)或链状结构悬于Td一点(Overhang)的模式与Td偶联，形成突环式(Td-Lanti-gfp)或悬点式(Td-Oanti-gfp)两种不同结构的Td-ASOs，用琼脂糖凝胶电泳与激光粒度分析仪进行鉴定。并进一步制备LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp，利用流式细胞术检测E.coli和S.aureus对LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp的摄取率。将GFP-E.coli与LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp共孵育后，利用激光共聚焦显微镜和RT-PCR技术检测GFP-E.coli荧光强度以及靶基因gfp表达的变化。
4.Td-Lanti-acpP的抗菌作用研究
采用基因抑制效果更佳的Td-L的设计思路，以acpP为靶基因，将E.coli与不同浓度的Td-Lanti-acpP和LP-Td-Lanti-acpP共孵育，利用RT-PCR检测靶基因acpP表达的变化；并以菌落形成单位(colony forming units, CFU)为指标检测其体外抗菌活性。
结果
1.Td的制备、表征及保存
首先依据文献中成熟的制备条件，成功制备了Td，其粒径小于10nm，呈三角状结构，水合粒径约为13nm。在Td制备影响因素实验中发现，缓冲液中Mg2+浓度为0.05和0.5mM时，Td自组装产率分别小于20%和55%，DNA链多以游离链结构的形式存在。Mg2+浓度为2和5mM时，成功制备出1、2、5、10μM的Td，产率约为70-80%；而在相同缓冲液中，制备20μMTd时DNA发生聚集，产率显著降低。随着Mg2+浓度的增加，DNA更易发生聚集，可成功制备的Td浓度逐渐降低。在Td冻存影响因素实验中发现，反复冻融不影响Td的结构；而在冻干过程中，Td结构的维持与Mg2+浓度相关，Mg2+浓度过高易造成DNA的聚集；且Td冻干粉的复溶与溶液种类相关，仅有水可成功复溶冻干粉，PBS、MHB及DMEM等复杂溶剂均会导致Td在溶解过程中发生聚集。
2.细菌摄取裸Td的效率较低，低剂量LP2000能显著增加Td的摄取率
我们在检测中发现，实验菌株(E. coli, S. aureus, S. flexneri, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii)与0.5μMTd共孵育后，细菌的平均阳性率为30-40%左右，当细菌经DNase处理后，阳性率显著降低，提示裸Td能够粘附于细菌外膜，干扰和掩盖细菌摄取Td的真实结果。因此，我们在检测细菌对Td的摄取率前，采用DNase处理细菌，以排除粘附于细菌外膜的Td干扰摄取检测结果的可能性，为同类研究提供了有价值的参考实验依据。
为了提升Td向细菌内的转运效率，我们将LP2000与Td混合制备LP-Td纳米复合物，筛选得到了LP2000最佳有效无毒比例为0.125μLLP2000/μgTd(LP2000的常用剂量为2-3μLLP2000/μgDNA)，制备的LP-Td粒径约为30nm。与裸Td的摄取率相比，E.coli和S.aureus对LP-Td摄取率显著提升，而该浓度的LP2000并不能向细菌内转运单链DNA(single strand DNA, ss DNA)，提示LP2000与Td发挥协同作用，促进细菌高效摄取LP-Td。同时，细菌对LP-Td的摄取率不受DNase处理的影响，提示LP2000可能通过增强Td疏水性和降低其负电荷密度的方式，使其不易在细菌表面形成粘附聚集，进而保证更多Td被细菌摄取。而且细菌对LP-Td的摄取迅速并呈浓度依赖性，低温(4℃)孵育对摄取率无影响，提示该摄取过程可能是非能量依赖型。
3.LP-Td能够向细菌内递送反义寡核苷酸，并有效抑制靶基因表达
在上述研究的基础上，我们设计了两种ASOs与Td的偶联方式，针对gfp基因，成功制备Td-Lanti-gfp和Td-Oanti-gfp，并与LP2000混合形成LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp，二者的水合粒径约30nm，与LP-Td相近。结果表明，E.coli与S.aureus对LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp的摄取率均无明显差别，但是仅LP-Td-Lanti-gfp表现出浓度依赖性抑制GFP-E.coli中gfp基因表达的作用，可使细菌荧光强度降低，而LP-Td-Oanti-gfp在本实验浓度下不能有效抑制靶基因gfp的表达。本研究结果提示，LP-Td能够向细菌内有效递送ASOs，并使其抑制靶基因的表达，同时ASOs与Td偶联的方式可以影响其靶基因抑制效果。
4.LP-Td-Lanti-acpP能够抑制细菌靶基因acpP表达，具有明显的抗菌作用
根据上述研究结果，我们制备了针对E.coli代谢关键基因acpP的LP-Td-Lanti-acpP。将LP-Td-Lanti-acpP与E.coli共孵育后，结果显示LP-Td-Lanti-acpP能够浓度依赖性的降低细菌靶基因acpP的表达，显著抑制E.coli生长，而错配组和阴性对照组并无细菌生长抑制作用。结果说明LP-Td-L可以作为反义抗菌寡核苷酸递送载体，抑制靶基因的表达，进而抑制细菌生长，发挥抗菌作用。
结论
1.Td的自组装和在保存过程中结构的维持与Mg2+浓度相关，水是Td冻干粉的良好溶剂。
2.证实了裸Td向细菌内转运的效率较低，低浓度LP2000能够促进Td向细菌内的转运。
3.证实了LP-Td可高效递送ASOs入菌，且ASOs与Td的偶联方式影响其基因抑制效果，与悬点式LP-Td-O相比，突环式LP-Td-L抑制细菌靶基因表达的效果更强，可有效抑制细菌生长。
多药耐药菌感染是临床抗感染治疗中极为棘手的难题，也是造成重症感染患者死亡的首因，因此，寻找有效控制耐药菌感染的新策略和新药物迫在眉睫。反义抗菌是一种具有全新作用模式的抗菌策略，以与细菌致病性、生存及耐药性相关的关键基因为靶点，利用人工合成的寡核苷酸分子阻断靶基因的表达，抑制靶基因的转录、翻译，达到降低细菌毒力、杀灭细菌或逆转细菌耐药性的目的。与经典抗生素相比，反义抗菌药物具有靶标明确、设计简单、制备工艺成熟等突出优势，已成为对抗耐药菌感染最具前景的方式。然而目前尚未有进入临床研究阶段的反义抗菌药物，制约其发展的最主要困难是裸的反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides, ASOs)难以穿透细菌胞膜进入细菌胞内发挥抗菌作用。这主要是因为ASOs分子量大、亲水性强、且多带负电荷的缘故。因此，在当前反义抗菌药物研究领域，需要解决将ASOs高效安全递送入细菌内的问题。
透膜肽-ASOs共价偶联是目前研究最为广泛的反义抗菌寡核苷酸递送方式，但该方式载药量低，合成成本高，仅适用于中性ASOs，且可能存在潜在的免疫原性，故目前仅限于实验室研究中。DNA纳米材料作为一种全新载体材料，是根据碱基互补配对原则，由多条DNA单链在一定条件下自组装形成的不同空间结构。其中DNA四面体(DNA tetrahedron, Td)是由四条或更多DNA单链组装成的四面体结构，合成简单、尺寸参数灵活可控、结构刚性强、修饰位点丰富且生物相容性好，受到广泛关注，研究也较为全面。业已证实，Td可携带小分子化合物(例如多柔比星、放射菌素D等与DNA具有亲和力的药物)或ASOs进入真核细胞，是一类极具应用前景的药物递送载体。
然而Td能否携带ASOs进入细菌，相关研究的文献极为匮乏。为了探讨Td能否作为ASOs的递送载体应用于细菌，需要阐明以下问题：①Td结构是否稳定？影响其制备和保存的因素有哪些？②Td可否被不同种属的细菌高效摄取？摄取具有哪些特征？③Td与ASOs如何偶联？其偶联方式是否影响ASOs在细菌内的抗菌活性？针对上述疑问，本课题首先探究了Td的制备及保存条件，随后以大肠杆菌(E. coli)，金黄色葡萄球菌(S. aureus )，福氏志贺菌(S. flexneri )，肺炎克雷伯杆菌(K. pneumoniae)，铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)，鲍曼不动杆菌(A. baumannii)为代表，探究不同菌株对Td的摄取特征，以gfp(编码绿色荧光蛋白，greenfluorescentprotein,GFP)和acpP(编码酰基载体蛋白，acylcarrierprotein,Acp)为靶点，设计ASOs分子，探究Td递送ASOs入菌的可能性，并探究Td与ASOs的偶联方式对ASOs靶基因抑制作用的影响，旨在探讨Td作为反义抗菌寡核苷酸递送载体的可行性，为反义小核酸抗菌药物的研发探索新路径、提供新思路。
方法
1.Td的制备、表征与保存
在含有不同Mg2+浓度(0.05、0.5、2、5、10、25、50 mM)的缓冲液中制备不同浓度的Td(1、2、5、10、20μM)，分别利用琼脂糖凝胶电泳、原子力显微镜、激光粒度分析仪进行结构鉴定与表征；通过电泳条带灰度扫描法计算Td产率。将不同条件下成功制备的Td经过冻融或冻干的处理后，鉴定其结构，探究两种保存方式中各因素(Td浓度，Mg2+浓度以及复溶溶剂等)对Td结构的影响。
2.细菌对Td的摄取研究
将前述不同种属的细菌(E. coli, S. aureus, S. flexneri, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii)与Td(FAM标记)共孵育1.5h后，先用DNase处理细菌(500U/mL，37℃，15min)以降解菌膜上可能存在的Td，然后利用流式细胞术与激光共聚焦显微镜检测细菌的阳性率。为进一步提高细菌对Td的摄取率，首先定量评价Lipofectamine2000(LP2000)对E.coli与S.aureus的毒性作用，随后在无毒剂量范围内，将Td与不同比例(0.0025、0.0125、0.025、0.125μL/μgTd)的LP2000混合，制备LP-Td纳米复合物，与E.coli与S.aureus共孵育后，利用流式细胞术检测细菌阳性率，并观察LP-Td浓度、孵育时间及温度对细菌摄取LP-Td的影响。
3.基于Td递送系统的设计及递送效率研究
为了探索Td递送ASOs入菌的可能性以及ASOs与Td的偶联方式对递送效率和基因抑制效果的影响，我们将抗绿色荧光蛋白基因的ASOs(anti-gfp)以环状结构突出于Td一边(Loop)或链状结构悬于Td一点(Overhang)的模式与Td偶联，形成突环式(Td-Lanti-gfp)或悬点式(Td-Oanti-gfp)两种不同结构的Td-ASOs，用琼脂糖凝胶电泳与激光粒度分析仪进行鉴定。并进一步制备LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp，利用流式细胞术检测E.coli和S.aureus对LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp的摄取率。将GFP-E.coli与LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp共孵育后，利用激光共聚焦显微镜和RT-PCR技术检测GFP-E.coli荧光强度以及靶基因gfp表达的变化。
4.Td-Lanti-acpP的抗菌作用研究
采用基因抑制效果更佳的Td-L的设计思路，以acpP为靶基因，将E.coli与不同浓度的Td-Lanti-acpP和LP-Td-Lanti-acpP共孵育，利用RT-PCR检测靶基因acpP表达的变化；并以菌落形成单位(colony forming units, CFU)为指标检测其体外抗菌活性。
结果
1.Td的制备、表征及保存
首先依据文献中成熟的制备条件，成功制备了Td，其粒径小于10nm，呈三角状结构，水合粒径约为13nm。在Td制备影响因素实验中发现，缓冲液中Mg2+浓度为0.05和0.5mM时，Td自组装产率分别小于20%和55%，DNA链多以游离链结构的形式存在。Mg2+浓度为2和5mM时，成功制备出1、2、5、10μM的Td，产率约为70-80%；而在相同缓冲液中，制备20μMTd时DNA发生聚集，产率显著降低。随着Mg2+浓度的增加，DNA更易发生聚集，可成功制备的Td浓度逐渐降低。在Td冻存影响因素实验中发现，反复冻融不影响Td的结构；而在冻干过程中，Td结构的维持与Mg2+浓度相关，Mg2+浓度过高易造成DNA的聚集；且Td冻干粉的复溶与溶液种类相关，仅有水可成功复溶冻干粉，PBS、MHB及DMEM等复杂溶剂均会导致Td在溶解过程中发生聚集。
2.细菌摄取裸Td的效率较低，低剂量LP2000能显著增加Td的摄取率
我们在检测中发现，实验菌株(E. coli, S. aureus, S. flexneri, K. pneumoniae, P. aeruginosa, A. baumannii)与0.5μMTd共孵育后，细菌的平均阳性率为30-40%左右，当细菌经DNase处理后，阳性率显著降低，提示裸Td能够粘附于细菌外膜，干扰和掩盖细菌摄取Td的真实结果。因此，我们在检测细菌对Td的摄取率前，采用DNase处理细菌，以排除粘附于细菌外膜的Td干扰摄取检测结果的可能性，为同类研究提供了有价值的参考实验依据。
为了提升Td向细菌内的转运效率，我们将LP2000与Td混合制备LP-Td纳米复合物，筛选得到了LP2000最佳有效无毒比例为0.125μLLP2000/μgTd(LP2000的常用剂量为2-3μLLP2000/μgDNA)，制备的LP-Td粒径约为30nm。与裸Td的摄取率相比，E.coli和S.aureus对LP-Td摄取率显著提升，而该浓度的LP2000并不能向细菌内转运单链DNA(single strand DNA, ss DNA)，提示LP2000与Td发挥协同作用，促进细菌高效摄取LP-Td。同时，细菌对LP-Td的摄取率不受DNase处理的影响，提示LP2000可能通过增强Td疏水性和降低其负电荷密度的方式，使其不易在细菌表面形成粘附聚集，进而保证更多Td被细菌摄取。而且细菌对LP-Td的摄取迅速并呈浓度依赖性，低温(4℃)孵育对摄取率无影响，提示该摄取过程可能是非能量依赖型。
3.LP-Td能够向细菌内递送反义寡核苷酸，并有效抑制靶基因表达
在上述研究的基础上，我们设计了两种ASOs与Td的偶联方式，针对gfp基因，成功制备Td-Lanti-gfp和Td-Oanti-gfp，并与LP2000混合形成LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp，二者的水合粒径约30nm，与LP-Td相近。结果表明，E.coli与S.aureus对LP-Td-Lanti-gfp和LP-Td-Oanti-gfp的摄取率均无明显差别，但是仅LP-Td-Lanti-gfp表现出浓度依赖性抑制GFP-E.coli中gfp基因表达的作用，可使细菌荧光强度降低，而LP-Td-Oanti-gfp在本实验浓度下不能有效抑制靶基因gfp的表达。本研究结果提示，LP-Td能够向细菌内有效递送ASOs，并使其抑制靶基因的表达，同时ASOs与Td偶联的方式可以影响其靶基因抑制效果。
4.LP-Td-Lanti-acpP能够抑制细菌靶基因acpP表达，具有明显的抗菌作用
根据上述研究结果，我们制备了针对E.coli代谢关键基因acpP的LP-Td-Lanti-acpP。将LP-Td-Lanti-acpP与E.coli共孵育后，结果显示LP-Td-Lanti-acpP能够浓度依赖性的降低细菌靶基因acpP的表达，显著抑制E.coli生长，而错配组和阴性对照组并无细菌生长抑制作用。结果说明LP-Td-L可以作为反义抗菌寡核苷酸递送载体，抑制靶基因的表达，进而抑制细菌生长，发挥抗菌作用。
结论
1.Td的自组装和在保存过程中结构的维持与Mg2+浓度相关，水是Td冻干粉的良好溶剂。
2.证实了裸Td向细菌内转运的效率较低，低浓度LP2000能够促进Td向细菌内的转运。
3.证实了LP-Td可高效递送ASOs入菌，且ASOs与Td的偶联方式影响其基因抑制效果，与悬点式LP-Td-O相比，突环式LP-Td-L抑制细菌靶基因表达的效果更强，可有效抑制细菌生长。