【摘 要】
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白酒窖泥中栖息着大量丁酸菌,与白酒中重要风味成分丁酸乙酯的前体物质丁酸形成密切相关。丁酸菌的数量和种类很大程度上影响着白酒的风味和口感。丁酸及其衍生物也广泛运用于饲料、化工、食品、医药等行业。本论文从浓香型白酒中分离筛选出高产丁酸的细菌,通过基因组测序与功能注释对其进行生理特性解析,并通过正交设计和响应面优化探究产丁酸最佳发酵条件,主要结果如下:（1）丁酸菌的分离、筛选及鉴定:在厌氧条件下,通过传
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白酒窖泥中栖息着大量丁酸菌,与白酒中重要风味成分丁酸乙酯的前体物质丁酸形成密切相关。丁酸菌的数量和种类很大程度上影响着白酒的风味和口感。丁酸及其衍生物也广泛运用于饲料、化工、食品、医药等行业。本论文从浓香型白酒中分离筛选出高产丁酸的细菌,通过基因组测序与功能注释对其进行生理特性解析,并通过正交设计和响应面优化探究产丁酸最佳发酵条件,主要结果如下:（1）丁酸菌的分离、筛选及鉴定:在厌氧条件下,通过传统培养技术,从浓香型白酒窖泥富集液内分离筛选得到32株高产丁酸的功能菌,通过分子生物学鉴定初步确定32株菌隶属于芽孢杆菌属、肠球菌属、梭菌属、Lacticaseibacillus属、葡萄球菌属、鲁梅尔芽孢杆菌属、副梭菌属、哺乳动物球菌属和链球菌属。选取芽孢杆菌属、梭菌属以及乳酸菌中产量最高的菌株进行生理生化特性实验并构建系统发育树,确定后续实验菌株为AB2RH05-2（Bacillus toyonensis）、AB2RH033（Clostridium butyricum）以及AB2RH057（Enterococcus faecium）。耐受性实验显示菌株AB2RH05-2的最适生长温度为40℃,可耐受10%vol的酒精浓度,p H耐受范围5-9;菌株AB2RH033最适生长温度35℃,能耐受16%vol的酒精浓度,酒精耐受性强,p H生长范围为5-9;菌株AB2RH057最适生长温度37℃,能耐受7%vol的酒精,p H生长范围为5-9。（2）基因组测序及代谢分析:通过Illumina Nova Seq测序平台对3株菌AB2RH05-2（B.toyonensis）、AB2RH033（C.butyricum）以及AB2RH057（E.faecium）基因组进行了测序。B.toyonensis基因组全长5421357 bp,GC含量35.94%,编码蛋白质的基因5517个,编码RNA基因219个。C.butyricum基因组全长4547232 bp,GC含量28.56%,编码蛋白质的基因4191个,编码RNA基因172个。E.faecium基因组全长2660844 bp,GC含量38.24%,编码蛋白质的基因2592个,编码RNA基因184个。COG注释显示B.toyonensis中有4520个蛋白获得COG号,C.butyricum中有3512个蛋白获得COG号,E.faecium中有2178个蛋白获得COG号,3者基因组中蛋白主要参与碳水化合物转运、氨基酸的转运和代谢及离子转运和代谢等。通过KAAS注释构建了丁酸合成途径,发现B.toyonensis和C.butyricum除α-D-葡萄糖和β-D-葡萄糖的转化途径及丁酸代谢过程中极少数酶不同外,丁酸代谢过程编码的基因和产生的酶几乎一致,而E.faecium以葡萄糖作为底物时丁酸代谢途径不完整。（3）AB2RH05-2（B.toyonensis）发酵产丁酸的优化:通过响应面发对菌株AB2RH05-2发酵产丁酸进行了培养基优化。通过基因组测序的注释结果,对碳氮源的利用情况进行了验证,并探究菌株生长的最适碳氮源,最终确定最佳碳源为葡萄糖,最佳氮源为胰蛋白胨。通过PB实验筛选出主要影响因素,再利用最陡爬坡实验确定影响最大的三个因素,最后利用Box-Behnken实验设计,最后的到优化后的RCM培养基,成分为:葡萄糖10 g,Na Cl 3 g,酵母膏4 g,胰蛋白胨9.4 g,乙酸钠12 g,牛肉膏8 g,可溶性淀粉0.8 g,L-半胱氨酸盐酸盐0.4 g。对发酵周期进行了探究,确定菌株AB2RH05-2在发酵84 h时丁酸含量最高。采用单因素法对发酵产丁酸的培养条件进行了优化,最后得到优化后的发酵条件为:培养温度37℃,p H为8,酒精浓度1%vol。最终丁酸产量为15.5 g/L,相比优化前3.32 g/L提高了3.7倍。
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