研究背景与目的：抗生素耐药已成为降低幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）根除治疗成功率的最主要因素之一，阐明细菌耐药机制愈发显得重要。在H.pylori对甲硝唑耐药机制研究领域，学者一致认为编码氧不敏感硝基还原酶的rdxA和编码黄素氧化还原酶的frxA基因发生突变是H.pylori对甲硝唑产生耐药的主要机制。但对于frxA在耐药中的贡献存在争论，近期研究表明rdxA突变通常是甲硝唑敏感株变为耐药株所必需的，单独frxA失活并不足以诱导耐药表型产生。英国和日本学者分析发现frxA失活同样存在于敏感菌株中，因此推断rdxA突变可能是承担H.pylori甲硝唑耐药表型的核心。然而，rdxA突变位点与耐药表型之间的相关性尚不清楚。此外，大量临床试验和Maastricht Ⅳ共识都明确表明H.pylori甲硝唑体外药敏试验结果与临床预后一致性较差，而CLSI（The Clinical andLaboratory Standards Institute）和EUCAST（European Committee on AntimicrobialSusceptibility Testing）规定8μg/ml为敏感性折点，该折点是否对于预测临床治疗结果最为合理，尚需进一步探讨。为了探究这些问题，本研究将分析体外诱导的甲硝唑耐药菌株中rdxA基因编码氨基酸序列的突变特征，并分析1439株中国菌株甲硝唑MIC值分布特点，并与EUCAST数据库中来自不同国家地区的11168株H. pylori甲硝唑MIC分布结果相比较，探讨H.pylori对甲硝唑的耐药机制。在此基础上，联合甲硝唑药代动力学分析结果，对当前H.pylori甲硝唑敏感性折点的合理性展开讨论。方法：（1）体外筛选甲硝唑耐药的H.pylori菌株：1×108CFU菌量的标准菌株H. pylori26695分别接种至含不同浓度甲硝唑的培养基上（A组：8μg/ml；B组：32μg/ml），培养3～5天；（2）挑取耐药单克隆，扩大培养，收集并提取基因组DNA；（3）针对rdxA基因和frxA基因设计特异性全长测序引物；（4）扩增目的基因，扩增产物送测序；（5）生物信息学分析：AlignX和MEGA分析基因和氨基酸水平变化，SMART analysis service、DomPred、Swiss-Model server和Pymol分析蛋白质功能域和空间结构；（6）耐药表型验证：A组筛选菌株接种至含8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml甲硝唑的平板；B组筛选菌株接种至含32μg/ml、64μg/ml和128μg/ml的甲硝唑的平板。37℃微需氧环境（5%O2、10%CO2和85%N2）培养2～4天，观察生长情况；（7）菌株MIC测定：E-test（AB Biodisk，Sweden）法测定体外诱导耐药菌株和来自中国的1439株临床菌株的MIC，参照CLSI方法，H.pylori26695和ATCC43504作为质控菌株；（8）统计学分析先前研究中临床菌株rdxA序列：pubmed和medline搜索关键词“Helicobacter pylori”、“metronidazole”、“resistant”、“rdxA”、“minimuminhibitory concentration”。选择具有rdxA基因序列和详细MIC数据的研究作为分析对象。MIC值与RdxA截短之间的相关性采取卡方检验，P＜0.05为具有显著性差异，SPSS16.0作为分析工具。（9）计算当前幽门螺杆局根除疗法中甲硝唑稳态血药峰浓度：利用Cssmax FD01ktmax公式计算。结果：（1）共筛选38株耐药菌（A组来源31株，B组来源7株），低浓度更易诱导耐药表型获得。提取获得相应基因组，成功扩增并测序rdxA和frxA基因。分析发现rdxA基因均发生突变（突变率100%），而frxA仅在2株中发生同义突变（突变率5.3%）。（2）氨基酸水平分析RdxA突变特征：根据基因序列翻译成氨基酸序列并与亲本菌株H.pylori26695RdxA比对，发现RdxA序列中所有突变位点均位于α（10～20th Aa）、β（30～80th Aa）和γ（140～180th Aa）区域，分布率分别为13.2%、68.4%和18.4%，80～140位氨基酸区内无突变发生。A组中21/3（167.7%）菌株其rdxA终止密码子提前，蛋白截短，其余菌株（10/31，32.3%）仅含1个氨基酸突变；而B组中来源的所有7株菌其RdxA均截短，且所有的截短位点均位于α区。总的来说，突变位点主要位于β区，约82.1%（23/28）。（3）结构分析突变的RdxA：截短位点位于56位氨基酸以前的RdxA无法预测到硝基还原酶结构域；以H.pylori26695RdxA为模板预测出38株菌中突变RdxA的3D模型，分析发现RdxA辅酶FMN的关键结合位点主要位于α、β和γ区，结构上看截短位置位于80位氨基酸之前的RdxA（A型模式）与FMN间的亲和力较截短位置位于140位氨基酸后的RdxA（B型模式）减少更多，而某一个点突变的全长RdxA（C型模式）其与FMN的结合口袋受到的影响可能很小。（4）含突变RdxA菌株的耐药水平：A型突变模式菌株都能在超过64μg/ml的甲硝唑压力下正常生长；B型突变模式菌株可在32μg/ml甲硝唑压力下生长，但仅少数菌株可在64μg/ml压力下存活；全部来自A组的C型模式突变菌株绝大多数仅可在32μg/ml以下抗生素浓度条件存活，除一株C148Y突变菌（验证发现可存活于256μg/ml以上甲硝唑压力条件）。（5）MIC结果：A型、B型和C型突变模式菌株其MIC范围分别为≥64μg/ml、≥32μg/ml以及8～32μg/ml（除C148Y突变株，MIC≥256μg/ml）。1439株来自中国的临床菌株MIC呈现连续性分布，其中977株为耐药菌（依据当前敏感性折点），耐药率为67.89%。与EUCAST数据库中11168株H.pylori的MIC分布比较发现，在中国近年来具有较高水平MIC的菌株所占比例较大。同时发现MIC为256μg/ml的菌株呈现集中分布特征态势。（6）既往研究中RdxA突变模式与MIC水平的相关性：2000～2012年10项研究中共194株临床菌，分为两组，即81株（MIC≤16μg/ml）和113株（MIC＞16μg/ml）。统计学处理发现两组中RdxA截短的发生率有显著性差异（9.88%vs56.64%，P＜0.001）。（7）400mg tid和500mg tid时稳态血药峰浓度分别为20.1μg/ml和26.0μg/ml。这与当前敏感性折点8μg/ml不符，中国菌株中错配比例超过12.5%（＞124/977）。结论：（1）低浓度甲硝唑更易诱导获得耐药表型，rdxA基因突变是承担甲硝唑耐药的主要因素，而frxA基因突变对甲硝唑耐药表型获得的贡献较小。（2）RdxA突变存在3个热点区，即α（10～20th Aa）、β（30～80th Aa）和γ（140～180th Aa）区，其中β区为主要突变区。构成FMN结合口袋的氨基酸突变或丢失可能会显著影响蛋白质功能。此外，148位Cys可能对RdxA功能至关重要。（3）RdxA突变模式与MIC水平具有一定的相关性：A型突变模式产生高水平耐药；B型突变模式产生中度水平耐药；C型突变模式主要产生低水平MIC。（4）MIC分布在8～＜256μg/ml范围呈现连续，而在256μg/ml呈现集中化，提示这可能是RdxA活性逐渐降低的过程，而MIC超过256μg/ml的菌株则获得了全部耐药机制。据此以及RdxA突变特征与MIC相关性，提出两种耐药类型：RdxA完全失活（Ⅰ型，质变）和部分失活（Ⅱ型，量变）。建议临床上MIC≥256μg/ml的菌株，完全放弃使用甲硝唑作为根除疗法的组分。（5）结合药代动力学数据、MIC分布特征及耐药机制证实当前H.pylori敏感性折点不合理。（6）建议设计以下临床试验确定具体合理的敏感性折点：①不同甲硝唑给药方式，如1.5g qd和500mg tid，在相同药物组合、剂量和疗程中比较H.pylori的根除差异；②明确不同MIC水平对含甲硝唑的三联或四联疗法根除率的影响；③相同甲硝唑给药方式在与不同抗生素组合时对H.pylori（MIC相同）根除率的影响。