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目的:肿瘤坏死因子受体1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的膜受体之一。TNFR1在人体内广泛分布于正常细胞膜表面,也存在于多种肿瘤细胞表面。TNFR1与配体TNF-α或TNF-β结合后,启动相关的信号通路,功能涉及到细胞的活化、增殖、凋亡及细胞毒活性等方面,但在不同的细胞,可以出现相反的结果,其作用机制目前尚不完全清楚。RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是由与靶基因序列同源的双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引发的普遍存在于生物体中的序列特异性基因转录后沉默过程,越来越广泛地应用于基础实验研究。本研究主要应用RNAi的实验方法,沉默食管癌细胞系EC109中TNFR1的表达,随后探讨对照组与实验组细胞增殖、凋亡等生物学行为的变化。材料和方法:1. EC109细胞用DMEM+F12培养基常规培养传代,RNAiso Reagent提取细胞总RNA,RT-PCR检测细胞中TNFR1在基因水平的表达。EC109细胞用DMEM+F12培养基常规培养传代,胰酶消化后收集贴壁生长的细胞,PBS清洗、离心、裂解,试剂盒分级提取可溶性亚细胞蛋白组分,所得膜蛋白进行Western Blot分析,检测EC109中TNFR1在蛋白水平的表达。2. EC109细胞用DMEM+F12培养基在六孔板内培养,在对转染条件进行优化后,对细胞进行转染,细胞分三组:空白对照组(未加转染试剂及siRNA),阴性对照组(加入转染试剂及阴性对照siRNA),实验组(加入转染试剂及TNFR1-siRNA)。RNAiso Reagent消化细胞后提取各组细胞总RNA,RT-PCR检验基因水平转染效果。试剂盒分级提取可溶性亚细胞蛋白组分,Western Blot技术检验蛋白水平转染效果。3.转染24小时后倒置相差显微镜观察细胞形态。4.将EC109细胞种于96孔板,对转染条件进行优化,细胞转染后用四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测转染前后细胞增殖能力的改变,绘制细胞生长曲线。5.收集转染后六孔板中各组细胞,应用流式细胞术检测细胞凋亡的变化情况。结果:1.由RT-PCR以及Western Blot等手段验证TNFR1在食管癌细胞系EC109中高表达。2.将TNFR1-siRNA转染进EC109细胞中,成功封闭了TNFR1的表达。3. RNAi处理后,三组细胞在形态上没有显示差别;RNAi处理后MTT检测结果显示,空白对照组和阴性对照组的细胞32小时内的细胞增殖没有差异(P>0.05),实验组的细胞增殖加快(P<0.05);RNAi处理后空白对照组和阴性对照组的细胞凋亡情况无差异(P>0.05),实验组的细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论:1. TNFR1在食管癌细胞系EC109中高表达。2.阻断TNFR1的表达使食管癌细胞的增殖、凋亡均发生变化,提示TNFR1在食管癌发生发展中发挥十分重要的作用。3.在食管癌细胞系EC109中,TNFR1主要发挥促进细胞凋亡的作用。