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畜禽传染病是对养殖业危害严重的一类疾病,不仅对社会造成巨大的经济损失,也给人类健康带来巨大威胁。疫苗接种是防控此类疫病的有效措施,传统的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治和消除传染病的流行中发挥了重要作用,但都存在一定安全隐患。亚单位疫苗是致病菌或病毒的具有免疫原性的表面结构蛋白,能诱发机体产生特异性免疫,且具有更高的安全性。哺乳动物乳腺为高效的蛋白合成和分泌器官,是制备具有复杂结构蛋白理想的生物反应器。本研究利用TALE切口酶介导的基因打靶将口蹄疫病毒(FMDV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)具有免疫原性的结构蛋白基因定点整合至山羊β-乳球蛋白(BLG)基因座,并通过体细胞克隆生产转基因动物;转基因动物乳中分离纯化得到的的重组蛋白(A-FMDV VP1和CSFV E2)用于小鼠免疫试验,结果表明乳腺表达的重组蛋白具有较好的免疫原性,能够诱发机体特异性体液免疫反应。本研究旨在建立一种利用动物乳腺生物反应器生产具有免疫原性病毒结构蛋白的技术体系,为利用乳腺生物反应器制备亚单位疫苗奠定研究基础。研究内容如下:1.靶向山羊BLG基因第2外显子TALE切口酶表达载体的构建使用“TAL Effector-Nucleotide Targeter(TALE-NT)2.0”筛选针对山羊BLG基因第2外显子(BLG exon2)序列的TALENs靶位点,并利用单元模块组装法构建TALENs表达载体pTALEN-E2-L和pTALEN-E2-R;构建包含TALENs靶位点序列和其同源的牛BLG基因序列的双荧光报告载体pRFP-GBE2-GFP和pRFP-BBE2-GFP;将以上报告载体分别与TALENs共转HEK293细胞,荧光表达结果显示靶向BLG exon2的TALENs可对其靶序列进行特异性剪切;使用单碱基突变法将TALEN表达载体pTALEN-E2-L FokⅠ450位氨基酸残基Asp突变为Ala得到pTALEN-E2-Lm,即将TALENs突变为TALE切口酶。2.EGFP基因在山羊BLG基因座不同整合位点的表达水平比较根据靶向山羊BLG exon1的TALENs(本实验室保存)和靶向山羊BLG exon2的TALENs的靶位点序列设计相应的基因打靶载体;PCR扩增同源臂DNA片段、EGFP基因片段以及bGHpA片段,以ploxpⅡ为载体骨架分别构建针对BLG exon1和BLG exon2的EGFP基因打靶载体pBTE1-EGFP和pBTE2-EGFP。使用打靶载体与相对应的TALENs表达载体共转染山羊乳腺上皮细胞(GMECs),经G418筛选和PCR鉴定分别得到EGFP基因定点整合至BLG exon1/exon2的细胞克隆12和14个;打靶阳性细胞克隆经激素诱导后,使用荧光定量PCR和Western blot在EGFP基因定点整合至BLG exon1/2的GMECs中均可检测到EGFP的表达,且整合至BLG exon2的细胞中EGFP表达水平较高。结果表明,定点整合至山羊BLG基因座的外源基因可以在内源性BLG基因调控序列的指导下表达并分泌到体外,且BLG第1内含子的存在对外源基因的表达有一定的促进作用。3.TALE切口酶介导的病毒结构蛋白基因在山羊体细胞中的定点整合及转基因克隆山羊的生产分别以质粒为模板PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5-M基因,猪瘟病毒(CSFV)E0、E2基因和牛A型和O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因序列,将扩增片段3’端连接bGHpA终止信号序列后,构建靶向BLG exon2的置换型基因打靶载体pBTE2-GP5-M、pBTE2-E0、pBTE2-E2、pBTE2-VP1_A、pBTE2-VP1_O。以pTALENE2-Lm和pTALEN-E2-R为模板体外转录制备编码TALE切口酶的mRNAs;并将其分别与以上各基因打靶载体共同电穿孔转染山羊胎儿成纤维细胞,经G418正向筛选、GANC负向筛选、PCR及测序鉴定分别得到GP5-M、E0、E2、VP1_A和VP1_O基因序列定点整合至BLG exon2的细胞克隆。以基因打靶阳性细胞为核供体,经体细胞核移植及胚胎移植共生产克隆山羊7只,经PCR、测序鉴定及Southern blot进行基因型分析,其中PRRSV GP5-M基因打靶山羊2只;CSFV E0基因打靶山羊2只;CSFV E2基因打靶山羊1只;A型FMDV VP1基因打靶山羊2只。以上结果表明,TALE切口酶介导的基因打靶技术可用于制备基因组中定点整合外源基因的山羊体细胞。4.基因打靶羊乳汁中重组蛋白的检测及其免疫原性验证对A型FMDV VP1和CSFV E2基因打靶奶山羊进行激素诱导泌乳,收集乳汁经脱脂和去除酪蛋白处理后得到乳清,将乳清样品SDS-PAGE之后进行考马斯亮蓝染色、Western blot及ELISA检测重组VP1(rVP1)和重组E2(rE2)的表达效率,其中乳清中rVP1和rE2浓度分别为1.02 mg/mL和1.46 mg/mL。乳清中的rVP1和rE2经Ni离子螯合亲和层析纯化,添加佐剂后分别免疫Balb/c小鼠,免疫后第4周可在小鼠血清中分别检测到FMDV和CSFV特异性抗体。以上结果表明,定点整合至山羊BLG exon2的外源基因可以利用内源性BLG调控序列在动物体内进行高效的表达分泌,且表达的重组病毒结构蛋白具有良好的免疫原性,能够诱发动物机体特异性体液免疫反应。综上所述,本研究利用TALE切口酶介导的同源重组将病毒结构蛋白基因定点整合至山羊BLG基因第2外显子,获得的转基因动物乳腺中能够分泌具有免疫原性的重组蛋白,为利用转基因动物乳腺生物反应器制备亚单位疫苗的研究奠定了基础。