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第一部分孕激素通过调控YAP表达促进心肌细胞增殖及心脏损伤修复研究背景:急性心肌梗死作为临床上常见的危重症之一,是冠心病最重要的死亡原因。心肌细胞的大量丢失是导致心肌梗死后发生心力衰竭甚至患者死亡的根本原因。实现对心肌梗死的彻底治疗,最根本的策略是应用有收缩能力的细胞来代替坏死的心肌,即通过心肌再生彻底治疗心肌梗死,恢复心功能。大量研究证据显示,心肌细胞增殖是心肌再生的主要来源,但哺乳动物在出生后短期,心肌细胞退出细胞周期,基本丧失增殖能力,其调控机制尚不清楚。要实现有效的心肌再生,需进一步阐明心肌细胞增殖调控机制并寻找促进心肌细胞增殖的有效方法。哺乳动物的心肌细胞在胚胎期具有较强的再生能力,但出生后心肌细胞快速退出细胞周期,基本丧失增殖能力,其原因尚不清楚。在众多研究的努力下,心肌细胞增殖的分子调控机制的神秘面纱已经初步被揭开。包括细胞周期基因,转录因子,细胞外因子等在心肌细胞增殖中的调控作用均已得到证实,但调控心肌细胞增殖的上游因素仍然不清楚。由于哺乳动物出生时脱离母体内环境,人们自然将研究重点放在孕期内环境和出生后环境差异上。出生前后心脏的氧环境和负荷差异均是导致出生后心肌细胞增殖停滞的重要原因。另外,出生前后心脏所处的激素环境发生大幅改变,已经有研究证实出生后甲状腺激素水平的升高是造成出生后心肌增殖能力下降的重要因素之一。众多的激素中孕激素在出生后下降幅度最大,并且孕激素的促增殖能力已在神经元等细胞中得到证实,因此我们推测其可能与出生前后心肌增殖调控存在一定关系。目的:（1）明确孕激素对心肌细胞增殖的调控作用。（2）阐明孕激素调控心肌细胞增殖的分子机制。（3）探索孕激素对成年心肌细胞增殖及心肌梗死后心脏修复的改善作用。方法:第一部分（1）我们首先通过酶联免疫吸附法（ELISA）检测胚胎16天（E16）、出生后1天（P1）、P7、P14时小鼠血清孕激素浓度,同时通过免疫荧光染色检测E16、P1、P7、P14时小鼠心肌细胞Ki67及磷酸化组蛋白H3（PH3）阳性率以评估心肌细胞增殖能力,然后分析出生前后血清孕激素与心肌细胞增殖能力变化的相关性。（2）接下来我们给予新生小鼠每天腹腔注射孕激素（8mg/kg.d）,于P7及P14时检测心脏体重比（HW/BW）,通过免疫荧光染色染色检测心肌细胞Ki67及PH3阳性率,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测心脏细胞周期基因表达,通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞以检测心肌细胞大小。（3）为了进一步证明孕激素对心肌细胞增殖的促进作用,我们提取并培养7天新生Sprague-Dawley（SD）大鼠心肌细胞,给予孕激素及孕激素受体拮抗剂RU486处理。通过免疫荧光染色染色检测心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,通过qRT-PCR检测心脏细胞周期基因表达。第二部分（1）为了明确孕激素对心肌细胞周期的调控及筛选介导孕激素促心肌细胞增殖效应的关键基因,我们应用孕激素处理培养的原代P7 SD大鼠心肌细胞后进行转录组测序。（2）根据基因表达变化初步筛选孕激素调控心肌细胞增殖的可能中间靶分子,并通过qRT-PCR和Western blot实验对其表达进行验证后,进一步筛选出可能的关键靶分子。（3）分离培养P7 SD大鼠心肌细胞,针对靶分子设计小干扰RNA（siRNA）并转染心肌细胞以沉默靶分子的表达,通过免疫荧光染色检测心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率以明确靶分子在孕激素促心肌细胞增殖中的作用。（4）我们构建了靶基因启动子-荧光素酶报告基因质粒并转染培养的心肌细胞,然后检测荧光素酶的活性以明确孕激素对靶基因启动子活性的影响;通过凝胶迁移阻滞（EMSA）实验检测孕激素受体与靶基因启动子的相互作用,同时通过染色质免疫共沉淀及荧光定量PCR（Ch IP-qPCR）实验检测孕激素受体在靶基因启动子区的富集度。第三部分（1）为了在体明确孕激素对成年心肌细胞增殖的影响,我们结扎小鼠冠状动脉前降支构建急性心肌梗死（AMI）模型,术后从P2开始经腹腔给予孕激素注射,于P7时通过制作心脏石蜡切片并通过免疫荧光染色检测梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后qRT-PCR检测细胞周期基因的表达。（2）心肌梗死后于P28利用小动物超声系统检测小鼠心功能,明确孕激素对心肌梗死后心功能的改善;同时P35时通过马松三色染色（Masson trichrome staining）检测心脏纤维化,明确孕激素对心肌梗死后心脏重构的保护作用。（3）为明确孕激素是否在成年心肌细胞依然促进靶基因的表达,心肌梗死后P7时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后进行qRT-PCR及Western blot检测孕激素对心肌梗死后靶基因表达的影响。结果:第一部分（1）心肌细胞Ki67及PH3阳性率从E16、P1、P7、P14依次降低,同时小鼠血清孕激素水平从E16、P1、P7、P14依次降低,二者的变化存在相关性。（2）于P7及P14时免疫荧光染色发现孕激素提高新生小鼠心肌细胞Ki67及PH3阳性率并促进细胞周期基因表达;孕激素对HW/BW无影响,但其处理后心肌细胞体积小于对照组。（3）孕激素提高原代P7 SD大鼠心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时这种作用被RU486阻断;孕激素促进原代P7 SD大鼠心肌细胞细胞周期基因表达,同时这种作用被RU486阻断。第二部分（1）转录组测序结果显示孕激素处理后,分别有2240个基因及2736个基因表达上下调超过1.4倍。基因本体分析（Gene Ontology,GO）及京都基因与基因组百科全书通路分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路分析显示与细胞增殖相关分子功能和信号通路出现大量上调基因富集。（2）我们根据基因表达变化初步筛选出4个介导孕激素调控心肌细胞增殖的可能中间靶分子,并通过qRT-PCR和Western blot实验对其表达进行验证后进一步筛选出上调幅度最大的yes相关蛋白（yes-associated protein,YAP）作为靶分子;同时通过YAP siRNA沉默YAP表达后,孕激素对原代P7 SD大鼠心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率的上调作用受到阻断。（3）荧光素酶报告基因实验表明孕激素处理后,心肌细胞荧光素酶活性升高,提示孕激素可以促进YAP基因启动子的转录活性;同时EMSA实验发现孕激素受体与YAP基因启动子存在相互作用,而Ch IP-PCR实验进一步显示孕激素受体在YAP基因启动子区存在富集,且孕激素存在时孕激素受体在YAP基因启动子区的富集增多。第三部分（1）通过结扎冠状动脉前降支,我们建立了小鼠急性心肌梗死模型。构建这一模型后于P7检测心肌心肌细胞增殖,我们发现孕激素可以显著提高梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率,同时促进心肌细胞细胞周期基因表达。（2）心肌梗死后P28小动物超声结果显示孕激素处理后小鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）及左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）均明显高于对照组小鼠;同时P35时马松三色染色结果提示孕激素处理组小鼠心脏左心室纤维化面积比低于对照组。（3）心肌梗死后P7时通过Langendorff灌流系统用酶消化法分离出心肌细胞后qRT-PCR及Western blot检测结果显示孕激素促进心肌梗死后心肌细胞YAP基因表达。结论:通过以上研究,我们得出以下结论。（1）胚胎期和出生后不同时期血清孕激素和心肌细胞增殖能力的变化存在相关性。（2）出生后补充孕激素可促进新生小鼠心肌细胞增殖,同时孕激素可以促进离体培养的原代P7 SD大鼠心肌细胞增殖。（3）孕激素对心肌细胞增殖的促进作用主要是孕激素受体在孕激素存在时,结合于YAP基因启动子区进而促进YAP基因转录实现的。（4）孕激素可以刺激成年心肌梗死后心肌细胞增殖并改善心功能和心脏纤维化。这一研究揭示了孕激素在心肌细胞增殖中的作用及机制,为心肌再生治疗心肌梗死提供了新的理论依据和靶点。第二部分DYRK1A在调控成年心肌细胞增殖中作用研究研究背景:心肌细胞丢失是心肌梗死后心衰发生的重要病理学基础,成年心肌细胞微弱的增殖能力为心脏损伤修复提供了希望。探索成年心肌细胞增殖的关键调控因子,对促进成年心肌增殖,改善心肌梗死的治疗具有重要意义。双特异性酪氨酸磷酸化调节激酶1A（DYRK1A）是一种在进化上高度保守的激酶,在调控细胞增殖、分化和存活等功能中发挥重要作用。既往研究证据表明,抑制DYRK1A可以抑制多种类型的肿瘤细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。同时DYRK1A对胰岛β细胞增殖也有强烈的调控作用,抑制DYRK1A可显著促进胰岛β细胞增殖,改善糖尿病的治疗。鉴于肿瘤细胞和胰岛β细胞均是难以调控增殖的细胞,提示DYRK1A可能是细胞增殖的强力调控因子。因此,我们推测DYRK1A可能对成年心肌细胞增殖具有调控作用。目的:（1）明确DYRK1A对成年心肌细胞增殖的调控作用。（2）探索DYRK1A调控心肌细胞增殖对心肌梗死后心脏修复的改善作用。方法:（1）通过Crispr-cas9系统,我们成功构建了能够条件性敲除DYRK1A的floxP小鼠(DYRK1Aflox/flox),通过将该小鼠与心肌细胞特性表达Cre重组酶的转基因小鼠(α-MHCMerCreMe)杂交,获得了α-MHCMerCreMer/DYRK1Aflox/flox小鼠,通过腹腔注射他莫昔芬诱导成年小鼠心肌DYRK1A敲除（DYRK1A CKO）,通过Western blot实验检验DYRK1A的敲除效率。（2）为了研究DYRK1A敲除对成年心肌细胞增殖的影响,我们结扎小鼠冠状动脉前降支构建急性心肌梗死（AMI）模型,于心肌梗死后7天（P7）时通过制作心脏石蜡切片并通过免疫荧光染色检测梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率。（3）心肌梗死前一天及梗死后每周利用小动物超声系统检测小鼠心功能,明确DYRK1A敲除对心肌梗死后心功能的改善作用;同时P35时通过马松三色染色（Masson trichrome staining）检测心脏纤维化,明确DYRK1A敲除对心肌梗死后心脏重构的保护作用。结果:（1）接受他莫昔芬腹腔注射的α-MHCMer Cre Mer/DYRK1Aflox/flox小鼠心脏DYRK1A蛋白表达显著低于对照组。（2）免疫荧光染色发现DYRK1A敲除显著提高了梗死边缘区心肌细胞Ki67、PH3及Aurora B阳性率。（3）小动物超声结果显示DYRK1A敲除组小鼠左心室射血分数（left ventricular ejection fraction,LVEF）及左心室短轴缩短率（left ventricular fractional shortening,LVFS）均明显高于对照组小鼠;同时P35时马松三色染色结果提示DYRK1A敲除组小鼠心脏左心室纤维化面积低于对照组。结论:通过以上研究,我们得出以下结论。（1）DYRK1A是成年心肌细胞增殖的重要调控因子,通过敲除DYRK1A可显著促进成年心肌梗死后心肌细胞增殖。（2）DYRK1A敲除可通过促进成年心肌细胞增殖改善心肌梗死后心功能和心脏纤维化。这一研究揭示了DYRK1A在成年心肌细胞增殖中的作用,为心肌再生治疗心肌梗死提供了新的理论依据和靶点。