【摘 要】
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目的:正常生理状态下,自身免疫调节因子（AIRE）能促进机体免疫耐受的形成和维持。AIRE主要在髓质胸腺上皮细胞（m TECs）中表达,可通过调控组织特异性抗原（TSAs）转录调节免疫耐受。胸腺上皮细胞（TECs）来源于内胚层（DE）,DE分化为胸腺上皮祖细胞（TEPs）后,进一步分化为皮质（c）TECs和m TECs,在T细胞正常发育和分化过程中发挥重要作用。本课题通过体外诱导小鼠胚胎干细胞（m
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目的:正常生理状态下,自身免疫调节因子（AIRE）能促进机体免疫耐受的形成和维持。AIRE主要在髓质胸腺上皮细胞（m TECs）中表达,可通过调控组织特异性抗原（TSAs）转录调节免疫耐受。胸腺上皮细胞（TECs）来源于内胚层（DE）,DE分化为胸腺上皮祖细胞（TEPs）后,进一步分化为皮质（c）TECs和m TECs,在T细胞正常发育和分化过程中发挥重要作用。本课题通过体外诱导小鼠胚胎干细胞（m ESCs）向TEPs分化,同时探讨敲低m ESCs AIRE基因对体外诱导分化的TEPs转录组的影响;并用NOD/Ltj（NOD）小鼠为自身免疫病模型,探讨敲低小鼠胸腺AIRE基因,对T细胞发育与分化,以及对小鼠1型糖尿病发生发展的影响。研究结果为AIRE调节免疫耐受的机制提供实验依据和理论基础。方法:1.以C57BL/6来源的m ESCs为研究对象,sh RNA慢病毒感染m ESCs,分为未处理组、Control sh RNA组和AIRE sh RNA组,嘌呤霉素筛选单克隆稳定株后,3组细胞定向诱导分化为TEPs,对3组细胞进行转录组测序,分析基因表达差异。2.以NOD小鼠为研究对象,5周龄NOD小鼠于胸腺内注射sh RNA慢病毒,分为未处理组（30只）、Control sh RNA组（30只）和AIRE sh RNA组（30只）,每周检测小鼠血糖2次,4W后取小鼠胰腺、胸腺和脾脏组织。（1）检测各组小鼠血糖变化。（2）HE及免疫荧光染色观察胰岛炎性细胞浸润情况,胸腺AIRE表达情况。（3）Real-time PCR检测胸腺内AIRE与T1D相关TSAs,以及m TECs的CD80和MHC-II表达情况。（4）流式细胞术（FCM）检测3组小鼠胸腺内T细胞比例变化。（5）FCM检测3组小鼠脾脏Tregs比例变化。（6）FCM检测3组小鼠脾脏T细胞增殖、活化情况。结果:1.敲低AIRE的m ESCs-TEPs,（1）有2383个基因上调,4487个基因下调。（2）KEGG富集结果显示,AIRE主要富集于ECM-受体间相互作用、PI3K-Akt信号传导途径、局部粘附、Ras信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路等途径。（3）通过TRING蛋白质互作数据库中的互作关系进行差异基因蛋白互作网分析,结果显示,AIRE通过与CD44的相互作用来影响ECM-受体间相互作用。2.NOD小鼠胸腺内注射sh RNA慢病毒研究发现:（1）与未处理组、Control sh RNA组相比,敲低胸腺内AIRE基因,可加速NOD小鼠T1D发病进程。（2）HE及免疫荧光染色结果显示,AIRE sh RNA组小鼠胰岛炎性浸润加重,胸腺AIRE表达降低。（3）与未处理组、Control sh RNA组相比,AIRE sh RNA组胸腺内AIRE及INS2、GAD67等T1D等相关TSAs的m RNA表达水平降低,m TECs发育成熟相关分子CD80、MHC-II的m RNA表达水平也降低。（4）AIRE sh RNA组胸腺内CD4单阳性T细胞比例增多,CD4CD8双阳性T细胞比例减少。（5）AIRE sh RNA组小鼠脾脏CD4+CD25+Foxp3+Tregs百分比降低。（6）AIRE sh RNA组小鼠脾细胞抗-CD3及Insulin刺激培养5d后,抗原特异性T细胞增殖增加;CD4+CD69+与CD8+CD69+细胞比例升高。结论:1.敲低AIRE的m ESCs来源的TEPs,ECM-受体间相互作用等途径发生改变。2.敲低NOD小鼠胸腺AIRE基因,加速小鼠T1D发生,加重胰岛组织病理学改变。这些改变可能与胸腺内T1D相关INS2、GAD67等TSAs表达降低,单阳性T细胞比例增多（中枢耐受受损）,致外周Insulin特异性T细胞增殖活化增加,而Tregs产生减少（外周耐受受损）有关。
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