微生物法生产L-色氨酸的检测及发酵过程优化

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L-色氨酸属于芳香族氨基酸,是动物生长所需要的8种必需氨基酸之一。在人和动物新陈代谢过程中,这种氨基酸无法自我合成,只能依靠水解食物中的蛋白质而从外界获得。色氨酸可有效的治疗抑郁症;也可添加到动物的饲料当中,来增加动物的食欲并且使动物的免疫力增强;同时作为防腐剂添加到奶粉或食物中,以预防其变质;农业上,作为农药稳定剂增加杀虫率。L-色氨酸特殊的功能与结构,使其可广泛应用于生活中的各个方面。本文以大肠杆菌作为生产菌株,对发酵生产L-色氨酸的工艺进行优化。研究了大肠杆菌的生理生化特性,为接下来的实验奠定了基础。建立了从发酵液中快速定量检测L-色氨酸的方法-可见分光光度法,此方法的线性关系良好,精密度和回收率也很高,且不受其他氨基酸的干扰。实验中考察了显色剂浓度、显色剂用量、加热时间、加热温度等因素对检测条件的影响,确定了最佳检测条件。本方法的线性范围为2080μg/mL,L-色氨酸的平均回收率为101.5%,RSD为1.08%,说明该方法的精密度良好。该方法与HPLC法进行比较误差较小,且该方法更加方便、灵敏。本文研究了影响L-色氨酸产量的两个关键因素:培养条件和发酵培养基成分。通过单因素实验,确定了最优培养条件:培养温度34℃,摇床转速240 rpm,培养基初始pH7.2,装液量30 mL/250 mL,接种量7%。通过响应面法对发酵培养基进行优化,首先用Plackett-Burman实验,从影响大肠杆菌生产L-色氨酸的7个因素中筛选出葡萄糖、KH2PO4和FeSO4这三个最显著因素。再利用SAS软件设计Box-Behnken实验对这三种显著因素的相互作用进行研究。最后通过该实验设计得到了最佳的培养基配方(g/L):葡萄糖34.5,酵母粉6,硫酸铵6,柠檬酸钠1,硫酸镁3,磷酸二氢钾20.7,硫酸亚铁0.44。用优化后的最佳配方进行发酵,发酵结束后,L-色氨酸产量达到8.12 g/L,比优化之前产量(3.72 g/L)提高了118.28%。本文最后探究了L-色氨酸的分离提取工艺,实验中采用001×7阳离子交换树脂对产物进行提取并同时使用活性炭脱色,对整个过程进行了优化。用单因素实验对吸附和洗脱过程进行研究,找到了最佳条件。进一步正交设计优化了脱色条件,即活性炭用量0.5%,pH=2,脱色时间20 min时,可达到最佳的脱色效果。最终得到L-色氨酸的总提取率为65.2%,纯度达到98.6%。
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