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植物病毒病是近年来严重危害加工番茄的主要病害之一，这与加工番茄种植面积不断扩大、栽培时间持续和重茬地大面积增加密切相关。黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus，CMV)和番茄花叶病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是严重危害加工番茄的两个主要病毒。在实际生产中，这两种病毒往往复合侵染加工番茄，使加工番茄上出现严重的条斑坏死症状，果实则表现为僵小畸形，表面易形成褐色斑块。严重影响加工番茄的产量和品质。多年来，人们一直都在努力地寻找解决病毒病对农作物的危害方法，而抗病毒育种是目前解决这一难题的主要策略，由于传统育种方法费时费力等局限性，从而大大地限制了育种工作的进程。近年来，随着植物基因工程技术的快速发展，尤其是RNAi技术的发展为解决这一难题开辟了一条新的途径。本研究以从加工番茄上分离出来的黄瓜花叶病毒分离物NS0-4和番茄花叶病毒分离物SCS-2的全长基因序列设计干扰靶序列，利用RNAi技术构建了一条抗CMV和ToMV加工番茄的技术体系。本文的主要研究内容如下:1. RNAi载体的构建：利用软件对CMV分离物NS0-4和ToMV分离物SCS-2全长基因序列进行分析，设计干扰片段，通过同位酶(BamHI/BglII)将两个干扰片段的序列进行拼接，同时以一段大小为266bp的核苷酸序列为内含子，构建了4个RNAi载体（pBi35STC4、pBi35STC9、pBi35STC12和pBi35STC14）。2.烟草遗传转化的研究：分别将4个重组质粒通过电击的方法导入农杆菌GV3101中，通过菌落PCR鉴定，表明重组质粒已被成功导入到农杆菌中。然后利用农杆菌介导的叶盘法转化普通烟（Nicotiana tabacum），经过卡那霉素（50mg/L）筛选及PCR鉴定，结果表明在转pBi35STC4的56株再生烟草植株中，有32株为转基因烟草；在转pBi35STC9的44株再生烟草植株中，有28株为转基因烟草；在转pBi35STC12的58株再生烟草植株中，有35株为转基因烟草；在转pBi35STC14的50株再生烟草植株中，有30株为转基因烟草。3.烟草上RNAi效果的初步评价：将转基因烟草、野生型烟草进行如下3种处理：第一种处理只接种CMV；第二种处理只接种ToMV；第三种处理同时接种CMV和ToMV。通过症状观察及RT-PCR检测，结果显示在接种20d野生型烟草100%均表现出了不同程度的病毒症状，在接种30d，转pBi35STC9烟草中近50%表现出了不同程度的病毒症状，而其余50%的烟草在40d后也表现出不同的病毒症状；而转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14烟草中，有10%～30%则在接毒40d表现出了病毒症状，结果表明在T0代转基因烟草中，转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14烟草可延迟病毒发生，抗病毒效果比转pBi35STC9烟草好。经过对转基因烟草的RNAi效果的初步评价为转化加工番茄奠定了基础。4.加工番茄遗传转化的研究：经过烟草的初步筛选，筛选出抗性较好的3个含重组质粒（pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14）的农杆菌，并将其转化加工番茄红番3号，通过卡那霉素（50mg/L）筛选及PCR鉴定，结果显示从1200个加工番茄子叶外植体中，获得27株转pBi35STC4加工番茄再生植株，经过PCR检测，其中有14株为转基因植株，转化效率为1.16%；从1500个加工番茄子叶外植体中，获得33株转pBi35STC12加工番茄再生植株，经过PCR检测，其中有19株为转基因植株，转化效率为1.26%；从1000个加工番茄子叶外植体中，获得23株转pBi35STC14加工番茄再生植株，经过PCR检测，其中有13株为转基因植株，转化效率为1.30%。5.加工番茄上RNAi效果的初步评价：将转基因加工番茄植株与转基因烟草一样分为3组做3种处理，通过机械摩擦接种病毒，随后观察症状和RT-PCR检测。结果显示野生型加工番茄在接毒25d时100%表现出病毒症状，而转pBi35STC4、pBi35STC12和pBi35STC14加工番茄在接毒40d仅有0%～20%表现出病毒症状。转pBi35STC12和pBi35STC14加工番茄延迟病症的发生20～25d；而转pBi35STC4加工番茄则只能延迟5～10d。总之，转pBi35STC12和pBi35STC14加工番茄对病毒的干扰效果要比转pBi35STC4加工番茄要好。这为获得抗多种病毒加工番茄奠定了基础。