论文部分内容阅读
研究背景与目的：由世界卫生组织(WHO)规定的,夫妇生活1年以上并且不采用任何的避孕措施,由于男方因素而造成女方发生不孕者,称为男性不育。男性不育症给人们的生活带来了很大的痛苦,给个人及社会造成了一定的负担。在世界上大约15%生育力低下的育龄夫妇中,由男性因素导致的不育占50%。而男性不育症主要表现在生精障碍方面。已经明确的与男性不育有明显相关的因素有很多,其中包括精索静脉曲张、梗阻、生殖系统感染、内分泌或免疫性疾病、环境毒物等,而涉及的遗传因素众多并且也非常重要。近年来经大量研究发现,染色体异常、Y染色体微缺失及相关基因的突变与男性生精障碍有关。1976年,Tiepol等发现6例无精子患者在Y染色体长臂远端发生了微缺失,并推测该区域应该存在控制精子发生的相关基因,故把此区域成为AZF。后来又先后有科学家对该区域研究进而推测AZF区微缺失与精子发生障碍有重要关系。L. Lazaros等人于2008年对希腊人群研究发现雄激素受体基因的(CAG)n和SHBG基因的(TAAAA)n的重复数的多少与精子的发生和精液的质量有关。2010年Mohammad Reza Safarinejad等人对芬兰人群进行研究发现了男性不育的相关基因：SHBG (Sex hormone binding globulin,SHBG)基因与男性少弱精症有关。另外,此基因rs6259(Asp327Asn)位点的突变导致增加了一个额外的糖链,从而引起SHBG的代谢清除率的减少,增加了SHBG的半衰期,并因此增加了SHBG的水平,通过改变雄激素和雌激素的利用度和行为,改变了雄激素和雌激素的生物活性,进一步导致男性不育。Mei-Tsz等人对台湾汉族人群雌激素相关基因进行了研究,发现SHBG的rs1799941位点和rs6259位点与男性生精障碍有关,是新发现的男性不育候选基因。本研究选取SHBG基因的两个位点(rs6259,rs727428)进行研究,以验证SHBG基因多态性是否与河南汉族人群男性不育相关。rs6259位点有研究发现与芬兰人群和台湾汉族人群男性不育有关但是还没有对中国河南汉族人群男性不育的相关性研究,而rs727428位点在国内外都没有对其与男性不育相关性的研究。本研究利用多重聚合酶链式反应(Mutiplex Polymerase chain reaction Mutiplex PCR)先对研究对象进行了Y染色体微缺失的检测,再利用聚合酶链式反应—限制性片段多态性技术(Polymerase chain reaction restriction-fragment length polymorphism, PCR-RFLP)对河南汉族人群SHBG基因的rs6259位点和rs727428位点多态性进行分析,研究其在河南汉族人群中的分布情况,及其与男性不育的相关性,从而为男性不育的临床检测与治疗提供相关理论依据。研究对象：1.病例组收集2011年3月-2011年8月来自郑州大学第一附属医院生殖中心及检验科门诊因不育来就诊的208例患者,年龄在25-45岁(平均年龄32.4±6.4岁)。患者均根据世界卫生组织(WHO)标准进行精液常规分析,并且排除睾丸炎、肝肾疾病、内分泌疾病、染色体异常、生殖器疾病等病症,经确诊为无精子或严重少精子病例作为研究对象。其中特发性无精症48例,少精症160例。精液常规检查参考检验科检查结果,连续三次检查确诊为无精子症、少精子症(精子密度<20×106/ml)。2.对照组随机选取健康且已经生育过孩子个体183例,年龄在25-45岁(平均年龄32.8+6.7岁)之间的作为正常对照组。以上病例、对照两组研究对象均是在其知情同意的原则下进行,且均为河南地区汉族人,饮食结构大致相似。研究方法：取研究对象被检测精液1mL,用常规经典的酚、氯仿法提取病例、对照组基因组DNA。设计、合成相应引物,用PCR仪扩增获取目的片段,再经HinfI限制性内切酶进行酶切,最后用3%及2%的琼脂糖凝胶电泳分别对多重PCR检测基因缺失、普通PCR及酶切检测基因的多态性。用紫外分析凝胶成像仪进行观察照相并且记录。统计学处理：所有得到数据处理均采用SPSS17.0统计软件和SHEsis在线软件进行统计学分析,基因频率使用数学计数法,检验水准为a=0.05。男性不育组与正常对照组之间基因型频率及等位基因频率的差异采用x2检验,用Hardy-Weinberg(HWE)平衡检验来估计群体所调查资料的可靠性,包括基因频率估计的准确性和可靠性。HWE平衡及单倍体型分析均用SHEsis在线软件(P>0.05)来检测分析。计算比数比(Odds Ratio, OR)及95%置信区间(CI),进行基因突变对此疾病发生风险度的估计。结果：1.本试验检测的208例男性不育患者中Y染色体AZF区微缺失的有25例,缺失率为12.02%,而正常对照组无缺失发生,二者相比有统计学意义。2.无精组与少精组Y染色体AZF区微缺失之间差异有统计学意义。3. AZFc微缺失有不同的临床表型。4.在河南汉族人群中,SHBG基因rs6259和rs727428位点基因型频率的分布都符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05),表明其具有良好的人群代表性。5.在河南汉族人群中,rs6259位点在男性不育组和正常对照组相比,基因型频率和等位基因频率差异具有统计学意义(P<0.05)。6.对SHBG基因rs6259位点按照年龄进行分层分析,在25-35岁之间的男性不育组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05)。7.对rs6259位点进行密度分组分析,GG基因型在轻度少精组和极重度少、无精组之间有显著差异(P<0.05)。8.在河南汉族人群中,rs727428位点在男性不育组和对照组相比,CC基因型频率差异有统计学意义(P<0.05)。9.在河南汉族人群中,对rs6259A/G和rs727428C/T两个位点在男性不育组与正常对照组间进行单倍型分析,发现A-T单倍型在两组间的差异有统计学意义(P<0.05)。10.rs727428位点多态性存在种族差异。结论：1.得出Y染色体AZF区微缺失是导致生精障碍的重要因素。2. AZFc缺失有不同临床表型。3.相对风险分析发现,SHBG基因rs6259A等位基因可能是河南汉族人群男性不育的遗传危险因子。4.相对风险分析发现,rs727428位点CC基因型是河南汉族人群男性不育发病的遗传保护因子,可能降低了男性不育的风险。5. SHBG A-T单倍型有可能是河南汉族人群男性不育发病的遗传危险因子。