目的:CRISPR/Cas9是目前运用最广泛以RNA为引导的基因编辑系统,具有核酸内切酶功能。与其类似的Ago2蛋白在5’磷酸化或羟基化修饰的gDNA引导下也具有核酸内切酶功能。然而Ago蛋白仅在高温发挥作用这一特点限制了其在哺乳动物中的运用。最近有新的报道表明Ago蛋白家族中的NgAgo蛋白在37℃可能降解RNA。本研究旨在探讨NgAgo-gDNA基因编辑技术在体外和细胞实验中的编辑能力,并鉴定其新的切割位点。方法:1.体外切割实验:采用双酶切的方法构建pET-24a(+)-NgAgo原核表达质粒,转化入大肠杆菌菌株中进行表达。通过IPTG诱导pET-24a(+)-NgAgo阳性菌株的表达,并纯化NgAgo蛋白;设计与被切割靶标RNA反向互补并以5’端磷酸化或羟基化修饰的gDNA;用体外转录的方式合成靶标RNA:GFP-RNA、HCV-RNA1和HCV-RNA2;设计切割反应,在体外进行NgAgo-gDNA切割靶标RNA的实验。收集并纯化切割体系中的总RNA,将总RNA逆转录成cDNA后进行PCR,将PCR产物进行测序,验证NgAgo-gDNA的切割位点。2.细胞内切割实验:构建pcDNA3.1-NLS-NgAgo真核表达质粒,设计与被切割靶标RNA反向互补并以5’端磷酸化或羟基化修饰的gDNA。将pcDNA3.1-NLS-NgAgo和相应gDNA共同转染入MCF-7/GFP细胞或5-8F/AKR1B10细胞中,观察相应靶标m RNA和蛋白质水平的变化情况。3.统计学分析:统计学分析采用GraphPad Prism7.00统计软件。计量资料以?x±s表示。两组比较采用t检验;多组比较采用One-way ANOVA。P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1.当同时加入NgAgo和相应gDNA时靶标RNA下面出现了两条比原带小的切割条带,随着切割时间的延长原带越来越弱,切割条带越来越明显,直到原带完全消失。推测这两条切割条带可能是NgAgo-gDNA切割出来的条带。测序结果显示RNA断裂的位点位于gDNA的5’端的第一个碱基。2.与对照组相比,同时转染pcDNA3.1-NLS-NgAgo和gDNA组的靶标m RNA水平表达降低,同时蛋白质水平表达降低。结论:1.NgAgo是以5’端磷酸化或5’端羟基化依赖的方式作用RNA而不是DNA。2.NgAgo-gDNA切割靶标RNA的断裂位点位于gDNA5’端的第一个碱基。