研究背景高通量单细胞转录组测序技术（Single-cellRNA sequencing,scRNA-seq）在解析细胞异质性,揭示机体生长发育机制和鉴定罕见细胞类型等方面具有独特的优势。目前scRNA-seq在动物和基础医学研究领域中已有广泛应用,然而在植物学的研究却严重滞后,主要原因是植物细胞壁和液泡的存在阻碍了植物单细胞的分离。利用水解酶消化细胞壁制备原生质体是植物单细胞转录组研究分离单细胞的主要方法,该方法已经在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）等模式物种中得到应用。但是该方法仍存在一些较为明显的弊端,例如只能用于新鲜样本、酶解组织类型有限、酶解过程中可能导致基因表达发生变化等。采用分离单核获得单细胞转录组的方法拓展了植物单细胞研究的方向,但目前只有少数基于荧光激活流式细胞分选（Fluorescent-activated cell sorting,FACS）的单核转录组研究（Single-nucleiRNA sequencing,snRNA-seq）被报道。然而流式细胞分选不仅增加了实验的成本和难度,分选过程对细胞核造成的机械损伤也降低了细胞核的产量。另外,迄今还缺乏植物单核转录组与基于原生质体的单细胞转录组的详细比较研究。研究目的本研究旨在通过优化植物细胞核分离方案,在植物中开展不依赖流式细胞分选的单核转录组测序研究。通过对比单核转录组以及单细胞转录组在实验流程和捕获数据上的差异,探索单核转录组测序技术在成熟植物组织中是否具有稳健性以及优势,为植物单细胞水平的大规模应用提供技术支撑。研究方法1.为了开展单核转录组测序研究,以拟南芥三周龄成熟叶片为实验材料优化已有细胞核分离方案进行研究,通过R语言的Seurat包构建其图谱。2.从多个角度对比snRNA-seq以及基于原生质体开展的scRNA-seq,研究,评估snRNA-seq是否能够产生有生物学意义的数据。3.为了测试snRNA-seq在植物研究领域是否具有广泛性,探索多种植物的细胞核制备方案,并开展大豆叶片的snRNA-seq研究。研究结果1.本研究成功获得了拟南芥叶片的snRNA-seq以及scRNA-seq数据,成功构建单细胞转录组图谱并鉴定到拟南芥叶片的5种主要的细胞类型。2.通过对比snRNA-seq与scRNA-seq,表明了相比于scRNA-seq,植物snRNA-seq不仅能够产生有意义的生物学数据,降低捕获细胞类型的偏倚性,还能减少酶解产生的基因表达的改变。3.通过优化拟南芥叶片细胞核的分离方法,本研究还获得了其他多个物种的细胞核悬液,包括杨树、番茄以及大豆的单核悬液,并在大豆叶片中开展snRNA-seq研究,构建了大豆叶片单核转录组图谱。研究结论本研究通过对比snRNA-seq以及scRNA-seq论证了不依赖FACS的snRNAseq方法在成熟植物组织中的稳健性,还证实了植物单核转录组研究方面重要的生物学意义,为单核转录组在植物中的广泛研究奠定了基础。