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1目的本研究以经典名方葛根芩连汤为研究对象,采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术快速分析鉴定葛根芩连汤中化学成分和入血成分,系统地阐明葛根芩连汤的药效物质基础;进一步运用网络药理学的方法,探究葛根芩连汤治疗急性肠炎的作用机制,包括揭示其关键成分、靶点和调节的通路等;最后建立葡聚糖硫酸钠诱导的急性肠炎大鼠模型,筛选预测的关键成分,对其药效和作用机制进行实验验证。希冀能为葛根芩根芩连汤的物质基础和作用机理研究奠定基础,为中药复方现代化研究提供新的思路。2方法2.1葛根芩连汤中化学成分的UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术建立葛根芩连汤中化学成分定性分析的方法,根据所获得高分辨质谱数据和对照品信息比对,快速分析鉴定葛根芩连汤中的化学成分。2.2葛根芩连汤中入血成分的UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS法进行葛根芩连汤血清药物化学分析,通过比较大鼠灌胃给药血清和空白血清的MS图谱,查找差异质谱峰,并根据相关色谱和质谱数据探究葛根芩连汤中的入血成分。2.3葛根芩连汤治疗急性肠炎作用机制的网络药理学研究以葛根芩连汤中入血成分做为候选活性成分,整合构建急性肠炎蛋白靶点数据库,通过高通量分子对接技术,模拟化合物与蛋白靶点之间的相互作用,构建“成分-靶点”网络图揭示葛根芩连汤中多成分多靶点的协同作用;构建蛋白互作网络分析蛋白之间的相互联系。进行GO分类富集分析说明葛根芩连汤治疗急性肠炎的目的基因参与的细胞组分、分子功能和生物学进程;KEGG通路分析来预测葛根芩连汤治疗急性肠炎的目的基因参与调控的信号通路。最后采用表面等离子共振分析技术（SPR）来验证网络药理学分析的结果,考察潜在关键性靶蛋白和活性化合物之间的亲和力。系统地阐明葛根芩连汤治疗急性肠炎的作用机制。2.4黄芩素对急性结肠炎大鼠PI3K/Akt/HIF-1α信号通路的影响通过建立急性肠炎大鼠模型,采用酶联免疫吸附法测定IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α含量,蛋白质印迹法测定PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和HIF-1α的表达水平,结合DAI评分、结肠炎大体损伤指数及病理切片评分,考察葛根芩连汤中关键成分黄芩素对急性肠炎大鼠的治疗作用和对PI3K/Akt/HIF-1α信号通路的影响。3结果3.1葛根芩连汤中化学成分的UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析通过对照品指认和软件预测分析,结合文献报道,从葛根芩连汤中共鉴定出67个化合物,包括黄酮类36个、生物碱类12个、三萜类及三萜皂苷类4个及其他15个。其中鉴定的36个黄酮类成分,来自于葛根、黄芩和甘草。所鉴定的12个生物碱类成分均来源于黄连,而4个三萜及三萜皂苷类成分来自于甘草。3.2葛根芩连汤中入血成分的UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱分析从给药后的大鼠血清中共鉴定出23种成分,包括13个黄酮类成分、7个生物碱类成分、2个三萜类化合物和1个香豆素类化合物。其中7个成分来自于黄连,6个成分来自于葛根,5个成分来自于黄芩,5个成分来自于甘草。3.3葛根芩连汤治疗急性肠炎作用机制的网络药理学研究通过高通量分子对接技术,预测发现葛根芩连汤的23个入血成分主要作用于41个潜在靶点发挥对急性肠炎的治疗作用。“化合物-靶点”交互作用网络分析推测黄芩苷、黄芩素、汉黄芩苷、甘草苷和大豆苷为葛根芩连汤治疗急性肠炎的关键性成分;蛋白互作网络分析推测ICAM1、MAPK14、AKT1和PPARG等为葛根芩连汤治疗急性肠炎的关键性潜在作用靶点。GO富集分析的结果表明这41个潜在目的基因参与的主要生物学过程有炎症响应和固有免疫应答等,主要的分子功能是蛋白激酶活性和三磷酸腺苷结合等,而细胞成分主要涉及细胞浆,细胞外间隙和细胞外区域等。KEGG通路富集分析发现,41个潜在靶蛋白涉及62条信号通路,根据P值进行排序,排名靠前的通路有HIF-1信号通路,PI3K-Akt信号通路和Toll样受体信号通路等。根据以上结果选取了代表性的蛋白和化合物进行表面等离子共振分析,验证了网络药理学分析的结果,证实了化合物和蛋白之间的亲和力。3.4黄芩素对急性结肠炎大鼠PI3K/Akt/HIF-1α信号通路的影响DSS诱导的模型组急性肠炎具有明显急性肠炎的病理特征,同时模型组大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等明显升高,结肠组织中p-PI3K的表达水平、p-Akt的表达水平以及HIF-1α的表达水平显著升高。与模型组相比,经黄芩素给药治疗后,大鼠体重增加,DAI评分降低,大鼠结肠组织的损伤和病理状况得到改善;炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等明显降低,p-PI3K、p-Akt以及HIF-1α的高表达得到明显抑制。4结论本研究采用UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱从葛根芩连汤中共鉴定出67个化学成分,23个原型入血成分,其主要为黄酮类成分、生物碱类成分和三萜类化合物。根据网络药理学分析,推测葛根芩连汤的23个入血成分主要作用于41个与炎症,免疫和肠粘膜相关的潜在靶点发挥对急性肠炎的治疗作用,同时根据“化合物-靶点”网络分析推测葛根芩连汤中关键性的成分为黄芩苷,黄芩素,汉黄芩苷等,蛋白互作分析推测推测ICAM1、MAPK14、AKT1和PPARG等为葛根芩连汤治疗急性肠炎的关键性潜在作用靶点。研究发现,葛根芩连汤可能主要通过调节HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路和Toll样受体信号通路等发挥对急性肠炎的治疗作用。研究结果表明葛根芩连汤中关键性成分黄芩素能通过抑制PI3K/Akt/HIF-1α信号通路的活化,抑制促炎性细胞因子的释放调节炎症反应从而发挥其对急性肠炎大鼠的治疗作用。