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目的:桂附地黄丸组方出自张仲景《金匮要略》肾气丸,具有补肾助阳、化气利水的功用,现代临床用于治疗前列腺增生效果甚佳,但因成分复杂所以机制研究受到限制。本文立足于前列腺增生的病因研究进展,通过网络药理学结合体内外药理学研究桂附地黄丸治疗前列腺增生的作用及作用机制,为中药的临床合理应用提供科学依据,以及为治疗前列腺增生可能的作用靶点提供新思路。方法:1.利用ADME参数筛选、成分的靶点预测与疾病靶点交集,基于贪心思想的最小集合覆盖算法优化得出活性成分与关键靶点,并采用Cytoscape绘制“活性成分-关键靶点”和关键靶点的蛋白间相互作用关系。2.GO与KEGG富集分析关键靶点涉及的生物学功能与信号通路。3.急性毒性实验研究小鼠对桂附地黄丸的最大耐受量。4.大鼠注射雄激素构建前列腺增生（BPH）疾病模型。大鼠分为正常组C1,模型组M1,阳性药组F,桂预低剂量组GL,桂预高剂量组GH,正常组C2,模型组M2,桂治组G。前五组在注射雄激素造模同时,给予相应药物28天（正常组和模型组灌胃等体积溶媒）,麻醉后采集血清,冻存8份;收集前列腺组织,福尔马林固定一份,冻存一份。后三组在造模三周后开始给予桂附地黄丸28天,其余同上。5.HE染色观察大鼠前列腺组织病理变化。6.ELISA检测大鼠血清、组织（DHT与性激素六项）和BPH1细胞（T、E2和DHT）的性激素、IL-6与PSA水平。7.生化试剂盒检测大鼠血清、组织和BPH1细胞的NO含量和i NOS活力。8.免疫组化观察大鼠前列腺组织的雄激素受体AR和雌激素受体ERα表达情况。9.MTT法检测BPH1细胞活力。11.实时荧光定量PCR检测BPH1细胞的Bax、Bcl-2、AR、ERα、ERβ、PSA、5α还原酶SRD5A2和Caspase-3 mRNA表达的影响。12.蛋白免疫印迹检测BPH1细胞的ERα、ERβ、Bax、Bcl-2、Cyclin D1蛋白表达。结果:1.最小集合覆盖算法优化出桂附地黄丸的31个活性成分覆盖106个关键靶点,处于PPI中心的蛋白为AKT1、STAT3、IL6、EGFR、VEGFA、JUN、KRAS、ESR1和FGF2。2.GO和KEGG-Pathway分析关键靶点,发现主要涉及1个基因作用位置（位于核染色质）,19个分子功能（包括转录调控区DNA结合、RNA聚合酶II启动子DNA特异性结合、转录激活子活性等）,10个生物学过程（DNA模板的转录的正调控、凋亡过程和对脂多糖的反应和MAPK级联等）以及27条信号通路（PI3K-Akt信号通路、乙肝、HTLV-I感染、蛋白聚糖在癌症中、催乳素信号通路、TNF信号通路、Ras信号通路、多种癌症和雌激素信号通路等）。3.小鼠对桂附地黄丸的最大耐受量96g/kg,且给药后两周内其体征、体重、饮食量无明显差异,小鼠的脏器无肉眼可见的异常。4.预防实验中,与正常组C1比较,模型组M1大鼠的体重在第三、四周显著降低（p＜0.05,p＜0.001）;M1组大鼠的前列腺重量、前列腺指数和肾指数显著增加（p＜0.001,p＜0.001,p＜0.001）。治疗实验中,与正常组C2比较,模型组M2大鼠体重在第六、七周显著低于C2组（p＜0.01,p＜0.05）;M2组大鼠前列腺重量、前列腺指数在第七周后均显著增加（p＜0.05,p＜0.001）。与M2组比较,桂治组G大鼠前列腺指数显著降低（p＜0.05）。5.与C1组比较,M1组大鼠前列腺腹侧叶的腔上皮较厚,乳头状突起多,腔面积小以及间质增生明显。各给药组与M1组比较,阳性药组F与桂预高剂量组GH腔上皮最薄,腔面积最大,乳头状突起最少,间质增生最少;桂预低剂量组GL次之。与C2组比较,M2组大鼠前列腺腔上皮较厚,乳头状突起多,腔面积小,以及间质增生明显。与M2组比较,G组腔上皮薄,腔面积大,乳头状突起少,间质增生少。6.预防实验中的大鼠血清,与C1组比较,M1组的T、DHT和LH均显著上升（p＜0.01,p＜0.01,p＜0.05）,PROG和FSH均显著下降（p＜0.05,p＜0.05）。与M1组比较,GH组的T和LH显著下降（p＜0.05,p＜0.05）,GL和GH的PROG显著上升（p＜0.05,p＜0.05）。预防实验中的大鼠组织,与C1组比较,M1组的T显著下降（p＜0.05）,DHT显著上升（p＜0.05）。与M1组比较,GL组的DHT显著下降（p＜0.01）。治疗实验中的大鼠血清,与C2组血清比较,M2组的DHT、PROG、LH和PROL均显著上升（p＜0.0001,p＜0.05,p＜0.01,p＜0.05）,FSH显著下降（p＜0.05）。与M2组比较,桂治组的DHT和PROL显著下降（p＜0.0001,p＜0.01）,FSH显著上升（p＜0.05）。治疗实验中的大鼠组织,与C2组比较,M2组的DHT均显著下升（p＜0.05）,LH和PROL均显著上升（p＜0.01,p＜0.01）。与M2组比较,G组的DHT显著增加（p＜0.01）。7.预防实验中,与C1组的大鼠血清比较,M1组的PSA含量显著降低（p＜0.05）,IL-6显著升高（p＜0.01）;与M1组大鼠血清比较,F组PSA显著升高（p＜0.05）,F组和GH组IL-6含量显著降低（p＜0.05,p＜0.01）。治疗实验中,与C2组的大鼠组织比较,G组大鼠的PSA和IL-6含量显著升高（p＜0.01,p＜0.05）;与M2组比较,G组大鼠的组织PSA含量明显下降（p＜0.01）,G组大鼠的组织IL-6含量无明显差异（p＞0.05）。8.预防实验中,M1组大鼠血清的NO含量以及i NOS活力显著高于C1组（p＜0.01,p＜0.05）;与M1组比较,各给药组大鼠的血清NO均显著下降（p＜0.05,p＜0.05和p＜0.01）。与M1组比较,F组血清i NOS活力显著下降（p＜0.05）。治疗实验中,M2组大鼠血清的NO含量显著高于C2组（p＜0.05）。9.预防实验中,与C1组比较,M1组大鼠前列腺AR和ERα蛋白表达降低。各给药组与M1组比较,AR和ERα蛋白表达均有所升高,且GH组的AR升高最明显,GL组的ERα升高最明显。10.桂附地黄丸提取物抑制前列腺增生细胞BPH-1增殖,且与浓度、时间有关。11.桂附地黄丸提取物处理后,前列腺增生细胞BPH-1培养上清的T、DHT和E2含量均下降（p＜0.001,p＜0.01,p＜0.05）。度他雄胺处理后,DHT含量显著下降（p＜0.05）。12.桂附地黄丸提取物处理后,前列腺增生细胞BPH-1内NO和i NOS活力变化无显著性差异（p＞0.05,p＞0.05）。13.桂附地黄丸提取物能显著降低前列腺增生细胞BPH-1内的AR、Bax和Caspase-3 mRNA表达（p＜0.01,p＜0.01,p＜0.01）,升高PSA、SRD5A2、ERα和Bcl-2mRNA表达（p＜0.05,p＜0.001,p＜0.001）,对ERβmRNA表达有双重作用。度他雄胺使前列腺增生细胞BPH-1内的AR、ERα、SRD5A2、Caspase-3 mRNA表达下降（p＜0.001,p＜0.01,p＜0.05）,PSAmRNA表达升高（p＜0.01）。14.桂附地黄丸提取物使前列腺增生细胞BPH-1内Bcl-2、Cyclin D1蛋白表达显著下降（p＜0.001,p＜0.001）。ERα蛋白表达在6.25 mg/m L显著上升（p＜0.001）,浓度12.5 mg/m L、25 mg/m L显著下降（p＜0.001,p＜0.001）。Bax蛋白表达在6.25 mg/m L显著下降（p＜0.05）,浓度12.5 mg/m L、25mg/m L显著上升（p＜0.001,p＜0.001）。结论:1.桂附地黄丸治疗前列腺增生的机制与DNA复制、增殖与凋亡过程、细胞因子或者应激刺激等生物学过程,以及PI3K-Akt、乙肝、HTLV-I感染、催乳素、雌激素、TNF和多种癌症等信号通路有密切关系。2.桂附地黄丸安全性较高,小鼠对桂附地黄丸的最大耐受量为96g/kg。3.前列腺增生（BPH）模型大鼠前列腺重量、指数显著增大;病理性检测显示上皮增生明显;给予桂附地黄丸显著降低BPH大鼠的前列腺指数,改善腺腔增生面积等病理变化。可能抑制作用机制:降低血清催乳素而降低对雄激素利用、降低BPH的组织二氢睾酮含量而阻断下游增殖信号与激活调亡信号通路;降低血清IL-6水平,恢复受损的AR表达从而改善炎性反应、阻滞BPH进程。4.桂附地黄丸提取物抑制前列腺增生细胞BPH-1增殖,推测可能的作用机制有以下三点:降低T和DHT含量可能提示了雄激素代谢过程的增强以维持细胞的正常性激素动态平衡;抑制ERα蛋白表达而抑制ER介导的上皮间质转化;促进Bax/Bcl-2蛋白表达比例,从而触发凋亡进程。