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目的随着传统生物医学模式逐渐被生物—心理—社会医学模式所替代,应激等负性心理因素与恶性肿瘤发生发展的关系也逐步引起人们重视。本研究旨在建立慢性应激状态下的小鼠宫颈癌细胞移植瘤模型,并探索常用化疗药物与苯二氮卓类药物对小鼠免疫功能及肿瘤发展进程的影响。方法首先利用Luc-TdT质粒转染小鼠宫颈癌U14细胞,依据荧光信号流式分选U14-Luc-TdT细胞,体外培养检测其生长情况,KM小鼠及C57小鼠体内移植检测成瘤性;分离并培养健康KM小鼠外周血中T细胞,建立U14-Luc-TdT细胞与T细胞共培养体系;化疗药物5-FU与苯二氮卓类药物咪达唑仑以不同浓度(5-FU 50、100、150mg/L,咪达唑仑 0.1、0.2、0.5mg/L)分别作用于U14-Luc-TdT细胞、T细胞及U14-Luc-TdT细胞与T细胞共培养体系,CCK8法检测U14-Luc-TdT细胞及T细胞生长增殖的情况,ELISA法检测U14-Luc-TdT细胞与T细胞共培养上清液中IFN-γ及TNF-α含量变化。选用6周龄雌性KM小鼠,分为移植瘤组、移植瘤+焦虑组、移植瘤+焦虑+5-FU组、移植瘤+焦虑+咪达唑仑组、移植瘤+焦虑+5-FU+咪达唑仑组。利用多种方式混合(不定时断水、彻夜强光照明、全天黑暗、迅速地明暗交替、剧烈地敲击鼠笼、摇晃鼠笼以及潮湿垫料)做为应激原建立小鼠慢性焦虑模型,按分组给予相应处理(5-FU40mg/kg体重隔天腹腔注射,咪达唑仑0.3mg/kg体重每晚9点腹腔注射)每三天测量小鼠移植瘤最长径及最短径,计算移植瘤体积并绘制生长曲线。D48脱颈处死小鼠,解剖取移植瘤、胸腺、脾脏,计算胸腺、脾脏指数。选用6周龄Balb/c小鼠,分对照组、5-FU组、5-FU+益生元组、5-FU+益生菌组、5-FU+益生元+益生菌组,按分组给予相应处理(5-FU 40mg/kg体重隔天腹腔注射,益生元0.5ml/只每日灌胃处理,益生菌0.5ml/只(1×109CFU/ml)每日灌胃处理)。持续2周后解剖小鼠,取肠组织,进行HE染色及免疫组织化学染色,观察组织病理变化及免疫、机械、化学屏障相关分子(Claudin-1,MUC2,CD45,Lysozyme(溶菌酶))表达情况的变化。结果荧光素酶及红色荧光双标小鼠宫颈癌细胞U14-Luc-TdT形态与母系U14细胞一致,荧光倒置显微镜下呈长梭形/圆形贴壁生长,可见红色荧光。加入荧光素酶底物D-Luciferin后活体成像仪检测到生物发光信号,体外连续传代至第15代细胞形态及荧光表达未见明显改变;U14-Luc-TdT细胞体外增殖在第2至4天处于对数生长期,第4至5天到达生长平台期,与母系U14类似;U14-Luc-TdT细胞小鼠体内移植后100%成瘤,与母系U14相同。5-FU对U14-Luc-TdT细胞的抑制随时间及浓度增加而增加(抑制率11.39%～53.22%);作用48h时咪达唑仑高浓度(0.5mg/L)对U14-Luc-TdT细胞有轻微的抑制作用(抑制率6.13%),浓度为0.1、0.2mg/L时肿瘤细胞增殖不受影响,作用72h时,咪达唑仑各浓度对U14-Luc-TdT细胞增殖均有轻微的抑制作用(抑制率5.85%～7.68%)。当 5-FU 为 100mg/L、150mg/L 时与咪达唑仑联用,对U14-Luc-TdT细胞增殖的抑制为相加作用(q值0.85～0.88)。在本研究设定的浓度范围内,5-FU对T细胞的增殖具有抑制作用且随时间及浓度增加更明显(抑制率39.13%～41.07%);咪达唑仑对T细胞的增殖有轻微的促进作用(抑制率-4.15%～-7.94%);5-FU与咪达唑仑联用时对T细胞的抑制率(21.76%～25.67%)较5-FU单用明显下降,二者联合作用时,q值0.6～0.7之间,对抑制T细胞增殖表现为拮抗作用。U14-Luc-TdT细胞与T细胞共培养时在不同浓度5-FU作用下TNF-α 及 IFN-γ 的含量均下降(OD0.09～0.27 vs 0.37;0.03～0.07 vs 0.21),而当咪达唑仑0.2mg/L及0.5mg/L时TNF-α的含量明显升高(OD0.56～0.58 vs 0.37),咪达唑仑 0.5mg/L 时 IFN-γ的含量明显升高(OD0.24～0.26 vs 0.21);5-FU 150mg/L+咪达唑仑0.5mg/L组合下TNF-α含量与单用5-FU 150mg/L时得以回升(OD0.13 vs 0.09),所有联用组合IFN-γ的含量均较单用该浓度5-FU时高(0.08～0.14 vs 0.03～0.07),即咪达唑仑与5-FU联用时不仅可有效减缓T细胞所受5-FU的抑制,还可一定程度挽救T细胞的免疫功能,恢复TNF-α及IFN-γ的分泌。采用不同应激原刺激小鼠制造慢性应激,并观察小鼠移植瘤生长及免疫功能,量化慢性应激中的焦虑情绪,利用高架O迷宫进行测试慢性焦虑模型,结果显示焦虑组小鼠明场持续时间较对照组小鼠短(29s vs 60s),而使用咪达唑仑0.3mg/kg连续一周后则可延长小鼠明场持续时间(89s vs 58s);移植瘤体内生长情况显示焦虑组移植瘤是全部5组生长进展最快的(平均瘤重14.6g vs 9.41g),焦虑促进了移植瘤的生长。而焦虑+5-FU+咪达唑仑组是全部5组中生长进展最慢的(平均瘤重4.37g vs 7.25or10.95),抗焦虑可协同化疗抑制移植瘤的生长;焦虑组的脾脏、胸腺指数均出现明显下降(7.80 vs 13.66;1.55 vs 4.79),焦虑+5-FU组及焦虑+5-FU+咪达唑仑组则胸腺指数出现下降(1.83,1.83 vs 4.97),而焦虑+咪达唑仑组则影响较小(2.63 vs 4.79),即焦虑对机体免疫器官脾脏、胸腺有损伤,5-FU对胸腺有抑制,抗焦虑可减请免疫器官的损伤。在5-FU对小鼠肠屏障影响以及益生元/菌保护作用的实验中发现与对照组相比,5-FU组小鼠肠皱襞及黏膜缺失破坏严重,淋巴小结境界模糊难辨,益生元组及益生菌组情况有所改善,但肠组织结构仍存在缺损现象,联合使用益生元、益生菌后肠组织结构基本完整,淋巴小结形态基本正常;5-FU组Claudin-1,MUC2,CD45,Lysozyme表达均下降,肠紧密连接及黏液层均遭到破坏,而联用益生元、益生菌则情况得到改善。结论本研究建立了荧光素酶/红色荧光双标的小鼠宫颈癌U14-Luc-TdT细胞株,体内具有成瘤性。咪达唑仑对U14-Luc-TdT细胞的增殖有轻微抑制作用。特定浓度咪达唑仑与5-FU联用,对U14-Luc-TdT细胞增殖的抑制表现为相加作用。咪达唑仑对T细胞增殖有轻微的刺激作用,5-FU对T细胞增殖有显著抑制作用。咪达唑仑与5-FU联用对T细胞增殖表现为拮抗作用。在U14-Luc-TdT与T细胞共培养体系中,咪达唑仑可显著缓解5-FU对T细胞的毒性作用,增加免疫因子TNF-α及IFN-γ的产生。体内实验显示慢性应激促进肿瘤的生长,可能与焦虑情绪对脾脏及胸腺造成损伤,降低机体免疫功能有关。咪达唑仑和/或5-FU联用可有效减缓肿瘤在小鼠体内的生长。5-FU可对肠免疫、机械、化学屏障造成损伤,益生菌与益生元联用可有效减少5-FU造成的肠屏障损伤。总而言之,本研究证实抗焦虑药物可轻微抑制肿瘤细胞增殖,并有保护机体免疫功能的作用,为临床抗焦虑药物在肿瘤在治疗中的应用奠定了实验基础。