防城港捕鸟蛛粗毒及主要活性成分研究

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防城港捕鸟蛛(Haplopelma fangcg sp.nov.)是一种体型较大的蜘蛛,隶属于节肢动物门(Arthorpoda)、有鳌亚门(Cheliceriformes)、蛛形纲(Arachnida)、蜘蛛目Araneae)、捕鸟蛛科(Theraphosidae)、捕鸟蛛属(Haplopelma),是近年从我国广西省防城港市山林地区发现的一蜘蛛新种。通过对防城港捕鸟蛛的蜘蛛粗毒进行膜片钳电生理活性研究发现:200μg/mL的粗毒几乎能完全抑制DRG细胞TTX-S型钠通道,其IC50值为42μg/mL;对海马神经元TTX-S钠通道有更强的抑制作用,80μg/mL的防城港捕鸟蛛粗毒对海马神经元TTX-S钠通道的抑制效果约90%,其IC50值为25μg/mL。对DRG细胞TTX-R型钠通道及钙通道均有较为明显的抑制作用且Ⅳ曲线均显示无明显移位,不影响其动力学特征。防城港捕鸟蛛粗毒对DRG细胞的钾离子通道仅有微弱的激活作用。根据以上研究结果表明,防城港捕鸟蛛粗毒是钠离子通道的高效抑制剂,同时它不可逆地阻断了小鼠膈肌神经肌肉传导推断出,该毒素可通过与离子通道的相互作用调节细胞的兴奋性。  利用反相高效液相色谱HPLC和离子交换层析分离纯化得到的防城港捕鸟蛛粗毒中含量最多的单一组分,经质谱鉴定其相对分子质量为3607.28 Da,该组分能有效抑制表达于HEK293细胞的KV1.1钾通道电流。经Edman降解法测定该多肽毒素氨基酸序列为:ECKGFGKSCVPGKNQCCSGYACNSRDKWCKVLL,氨基酸比对结果确定为一全新的序列,与海南毒素-Ⅰ(HNTX-Ⅰ)有97%的序列同源性,仅一个氨基酸残基的差别,且该毒素不存在于海南捕鸟蛛的cDNA文库中,为该多肽毒素命名为防城港毒素-Ⅰ(FCGTX-Ⅰ)。经膜片钳电生理活性进一步研究发现,500 nM的FCGTX-Ⅰ可以抑制KV1.1钾通道电流约60%以上且抑制作用明显具有浓度依赖性,其IC50值为354.81 nM。根据稳态激活曲线可以看出加入300 nM的FCGTX-Ⅰ不会使曲线发生很大的漂移,对KV1.1的激活动力学特征基本没有明显的影响。对FCGTX-Ⅰ的专一性研究结果表明,该毒素对其他钾通道亚型电流、钙离子通道电流、TTX-S型钠通道及TTX-R型钠通道电流均无明显影响,对NaV1.5通道电流也几乎没有作用,仅在10μM的高浓度下对NaV1.4通道电流有些许抑制作用。综合以上实验结果,FCGTX-Ⅰ对KV1.1钾电流有很强的抑制作用且专一性良好,对其激活动力学特征基本没有明显影响。根据本实验室有关研究表明HNTX-Ⅰ对中电导钙激活钾通道(IK)有激活作用,EC50值为26μM。而50μM的FCGTX-Ⅰ对IK通道没有激活作用,根据氨基酸序列比对结果可知,HNTX-Ⅰ与FCGTX-Ⅰ仅一个氨基酸残基的差别(HNTX-Ⅰ的第15个氨基酸残基为谷氨酸(E),FCGTX-Ⅰ的第15个氨基酸残基为谷氨酰胺(Q)),因此可以合理推测这第15个氨基酸残基为对IK通道有激活作用的关键残基。
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