论文部分内容阅读
肿瘤威胁人类健康。临床治疗肿瘤的手段有化疗、放疗和光热治疗，但存在毒副作用大、易产生多药耐药、光热治疗剂不可降解等缺点。紫杉醇(Paclitaxel，PTX)是临床抗肿瘤常用药物之一。主要用于卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、卡波西氏肉瘤等肿瘤的治疗。但存在骨髓抑制、神经毒性、心血管毒性、肝脏毒性等不良反应，且水溶性差、生物利用度低、易产生耐药性。20(S)-人参皂苷Rh2(20(S)-Ginsenoside Rh2，Rh2)从红参中分离得到的原人参二醇型低糖链皂苷单体。它可抑制多种肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡、逆转肿瘤多药耐药性。二者联合给药，协同增强抗肿瘤作用和逆转肿瘤多药耐药性。本课题设计了一种叶酸修饰金纳米粒杂化纳米结构脂质载体，联合递送紫杉醇和20(S)-人参皂苷Rh2，旨在降低药物毒副作用、主动靶向肿瘤部位并实现细胞内递送、克服肿瘤多药耐药等。具体研究内容如下: 1)合成紫杉醇巯基化产物(PTX-SH)，并采用核磁共振氢谱、碳谱、高分辨质谱表征PTX-SH，确证PTX-SH成功合成;建立了PTX-SH和Rh2的体外HPLC分析方法。 2)利用两相法，制备了金纳米粒紫杉醇轭合物(APC)和金纳米粒20(S)-人参皂苷Rh2复合物(ARC)。利用TEM、DSC、IR表征APC和ARC，确证APC和ARC形成。采用高压均质法制备叶酸修饰的载APC和ARC的纳米结构脂质载体(FA-PRA-NLCs)。FA-PRA-NLCs的平均粒径为157.6 nm，Zeta电位为-26.9 mV。采用TEM、DSC进行表征，确保成功载入APC和ARC。 3)以人乳腺癌细胞MCF-7细胞、MCF-7耐药细胞MCF-7/Adr细胞和高表达叶酸受体的MDA-MB-231细胞为模型，从细胞毒性、细胞摄取、细胞周期和细胞凋亡等方面研究该载药系统细胞水平的药效学。PRA-NLCs和FA-PRA-NLCs对MCF-7及MCF-7/Adr的细胞毒性显著高于载APC的纳米结构脂质载体(PA-NLCs)和载ARC的纳米结构脂质载体(RA-NLCs)，且存在剂量依赖性;光照可增强FA-PRA-NLCs对MCF-7/Adr的细胞毒性。FA-PRA-NLCs组对MDA-MB-231的细胞毒性均显著高于PRA-NLCs组，且叶酸受体竞争抑制后，FA-PRA-NLCs组的细胞毒性显著降低，而PRA-NLCs组的细胞毒性无显著差异;此外，细胞摄取结果显示叶酸修饰载FITC的纳米结构脂质载体(FA-FITC-NLCs)组的细胞摄取显著高于载FITC的纳米结构脂质载体(FITC-NLCs)组。结合以上MTT实验和细胞摄取实验的结果，均表明制剂修饰叶酸后具有靶向效果。通过流式细胞仪检测PRA-NLCs对 4)MCF-7/Adr细胞周期的影响，结果表明PRA-NLCs延长了S期，也阻滞于G2/M期，同时发挥了PTX和Rh2的协同作用。通过流式细胞仪检测FA-PRA-NLCs对MCF-7/Adr细胞凋亡的影响，FA-PRA-NLCs组总凋亡率与PA-NLCs组相近，比PRA-NLCs组小，但其细胞死亡率比二者大，表明在相同时间内，FA-PRA-NLCs更易杀死MCF-7/Adr细胞，肿瘤细胞增殖抑制作用更强。此外，克服多药耐药实验结果发现PRA-NLCs组与PA-NLCs组和RA-NLCs组相比，其MDR逆转率均具有显著增加，表明联合给药后，其逆转多药耐药能力显著增强。 4)为了评价联合给药和光热治疗的抗肿瘤效果，采用荷瘤裸鼠模型研究FA-PRA-NLCs的体内药效学。结果表明FA-PRA-NLCs组抑瘤效果较强，光热治疗可使肿瘤消融。HE染色结果表明该光照条件对肿瘤组织无毒副作用，FA-PRA-NLCs对肿瘤组织的损伤较强。Tunel分析结果证实FA-PRA-NLCs通过诱导凋亡发挥抗肿瘤作用。 以上实验结果显示叶酸修饰的金纳米粒杂化纳米结构脂质载体通过多种途径增强了抗肿瘤疗效，有望成为多功能抗肿瘤纳米载体。