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研究背景前列腺癌是危害男性健康的重要杀手,在男性癌症致死原因中排名第二。前列腺癌是一种雄激素依赖的恶性肿瘤,雄激素受体(androgen receptor,AR)通路对肿瘤的发生发展产生重要影响。雄激素剥夺治疗(androgen deprivation therapy,ADT)是治疗晚期前列腺癌的主要手段,然而,初次对雄激素剥夺治疗有反应的肿瘤,绝大部分会获得对ADT的耐受而出现肿瘤复发,这种肿瘤称为去势抵抗性前列腺癌(castrate-resistant prostate cancer,CRPC)。近年来,随着新一代抗雄激素受体通路药物(AR pathway inhibitors,APIs)的问世,患者的生存期得到明显延长。尽管如此,疾病的缓解仅能维持数年时间,随后肿瘤逐渐对APIs产生耐受,其中一部分肿瘤失去对雄激素的依赖,而转化成一种更具有侵袭性且带有神经内分泌(neuroendocrine,NE)特征的肿瘤,这种肿瘤称为神经内分泌型前列腺癌(neuroendocrine prostate cancer,NEPC)。有研究统计,从前列腺腺癌(androgen-dependent prostate cancer,AdPC)发展成为 NEPC 需要数年的时间,而从NEPC出现到患者死亡仅需数月时间,因此研究AdPC向NEPC转化的过程和机制对于及时监测疾病发展过程及寻找有效治疗靶点具有极为重要的意义。AdPC是一种雄激素依赖性的肿瘤,具有前列腺腺癌(adenocarcinoma,AD)相关的谱系特征,表达AR、KLK2、KLK3、NKX3-1、SPDEF等标志;而NEPC是一种雄激素非依赖的,具有NE特征的恶性肿瘤,表达SOX2、ENO2、CHGA、CHGB、SYP等标志。谱系可塑性(lineage plasticity)是指细胞失去原本谱系特征,而获得其他种类细胞的谱系特征的性质。近年来,人们认为谱系转换在NEPC的发生中发挥了重要作用。原发性NEPC十分罕见,实验室和临床数据提示大多数NEPC是由AdPC转化而来。AdPC向NEPC的转化过程是一个复杂而又精密的网络,多种转录因子、细胞因子及某些抑癌基因参与其中,研究参与调节这一转化过程的分子及病理机制是近年来此领域的热门话题。刺猬信号通路(hedgehog signaling,Hh signaling)是一种十分古老而保守的信号通路,在两侧对称性动物的胚胎发育中发挥必不可或缺的作用。脊椎动物胚胎期,Hh通路在大脑、胃肠道、肺、骨骼肌肉系统和前列腺的发育中发挥重要的调节作用。近年来人们研究发现,Hh信号通路在维持肿瘤干细胞多能干性以及肿瘤发生发展中发挥不可忽视的作用。在前列腺癌中,癌组织与癌旁组织之间,原位癌与转移癌之间,Hh信号通路相关基因均有差异性表达,进一步研究发现Hh信号通路在前列腺癌中通过旁分泌或自分泌的方式调节肿瘤细胞增殖、上皮向间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)从而促进肿瘤的进展。另外,在雄激素缺乏的条件下Hh通路可作为AR通路的替代通路维持前列腺癌细胞的生存,促进CRPC的形成。NEPC是一种特殊类型的前列腺癌,Hh信号通路与NEPC的关系尚未有报道。已知Hh通路在前列腺癌的发生及去势抵抗的形成中发挥重要作用,并且AdPC可通过谱系转换形成NEPC,我们推测Hh信号通路在NEPC形成过程中发挥一定作用。研究目的以公共数据库数据为基础,阐述Hh信号通路相关基因在AdPC向NEPC转化过程中的变化规律,明确在AdPC和NEPC中差异表达的Hh通路相关分子,并进一步探讨smoothened(SMO)在前列腺癌神经内分泌转化过程中的调节作用及机制,为NEPC的诊断和治疗提供新的理论基础。研究方法1.检索公共数据库中同时包含AdPC和NEPC两种类型肿瘤的表达谱数据,比较两种类型肿瘤中Hh通路相关基因表达的差异。2.收集 6 例 AdPC、5 例 NEPC、5 例 AdPC 伴 NE 分化、2 例 AdPC 与 NEPC的混合体以及22例高级别AdPC肿瘤标本,通过免疫组化试验验证SMO在AdPC和NEPC中表达的异质性。3.分析人源化前列腺癌动物模型LTL331/331R在AdPC向NEPC转化过程中AR通路相关分子、NE标志、NE相关转录因子以及SMO基因表达的变化。4.分析公共数据库中SMO基因变异情况,体外去雄培养前列腺癌细胞,以及体外加药(JQ1)处理细胞,探讨SMO基因表达变化的原因。5.将公共数据库中前列腺癌病例根据SMO基因表达的高低分为两组,通过GSEA(gene set enrichment analysis)推算可能与SMO表达相关的信号通路。6.通过慢病毒构建SMO敲减的前列腺癌细胞株sh-SMO,对照组细胞株sh-NC。利用real time PCR技术和western blotting技术检测SMO敲减效率;同时检测sh-SMO组和sh-NC组AR通路相关基因(AR和PSA)表达变化。使用Gli抑制剂和Hh激活剂,抑制或者激活前列腺癌细胞Hh通路活性,检测不同处理组细胞中AR和PSA表达变化情况。7.使用cDNA-Gli1质粒瞬时转染sh-SMO组和sh-NC组LNCaP和C4-2B细胞,利用western blotting技术检测AR和PSA基因表达变化情况。8.利用real time PCR技术和western blotting技术检测sh-SMO和sh-NC组细胞中NE相关指标表达情况;连续去雄培养sh-SMO和sh-NC组LNCaP细胞,检测SYP和CHGA表达变化情况。9.利用CCK-8试验和划痕试验检测sh-SMO和sh-NC组细胞增殖和迁移活性,探讨SMO基因对前列腺癌细胞体外功能的影响。研究结果1.NEPC中SMO mRNA表达水平明显减低从cBioportal和GEO数据库中下载同时包含AdPC和NEPC临床标本的转录组表达数据集共6个,比较Hh通路关键基因(SHH、PTHC1、SMO、Gli1、Gli2、Gli3)在AdPC和NEPC之间mRNA水平表达的差异性。结果显示,SMO在AdPC和NEPC中差异性表达最明显,在NEPC中表达明显减低。从CCLE和LTL数据库获得前列腺癌细胞系和人前列腺癌同种异型动物模型表达数据,分析结果再次证实SMO在NEPC中显著性低表达。2.SMO蛋白在NECP组织中表达明显减低免疫组化结果显示:SMO在AdPC、AdPC和NEPC混合标本的AdPC区域以及伴有NE分化的AdPC中均为阳性表达;然而,在NEPC、AdPC和NEPC混合标本的NEPC区域,SMO表达缺失。AR通路基因(AR)和NE相关指标(SYP和CHGA)也同时进行了免疫组化染色,SMO与AR表达呈明显伴随关系,而与SYP和CHGA表达呈互斥关系。3.SMO在LTL331/331R模型的神经内分泌转化过程中的表达变化特点在LTL331/331R人前列腺癌同种异型动物模型中,随着疾病由AdPC进展成为 NEPC,AR 通路的特征基因(AR,KLK3,TMPRSS2,NKX3-1,SPDEF)表达逐渐降低甚至消失,NE标志分子(CHGA,ENO2,SYP,SCG3)表达逐渐升高到达最高峰,NE相关转录因子(ASCL1,SOX2,PEG10,BRN2,SRRM4)呈现不同程度的升高。SMO基因在前12周表达相对稳定,从12周开始连续下降直至肿瘤复发成为NEPC,其变化特点类似于REST和YAP1。4.前列腺癌中SMO的表达受表观遗传学机制调控分析上述公共数据集中SMO基因突变和拷贝数变化在AdPC和NEPC中的差异,发现基因突变和拷贝数变化不能解释SMO在NEPC中选择性低表达的现象。体外去雄处理亦不能改变SMO的表达,而BRDs抑制剂(JQ1)可下调LNCaP和C4-2B细胞中SMO表达。因此前列腺癌中SMO表达变化并不是基因变异和AR通路活性变化所致,可能是表观遗传学调控的结果。5.SMO表达减低与NEPC关键特征通路相关将上述公共数据库下载的前列腺癌数据按照SMO表达水平由低到高排序,将SMO低于前1/4者命名为“SMO-LO”组,其余病例命名为“SMO-HI”组。应用GSEA分析两组病例表达谱相关通路的差异。结果显示:SMO表达与“ANDROGENRESPONSE”、“CHOLESTERHOMEOSTASIS”正相关,与“E2FTARGETS”、“PANCREASBETACELLS”和“G2MCHECKPOINT”负相关。6.敲减SMO下调AR通路活性及AR基因表达sh-SMO组与sh-NC组相比较,Gli1、AR、PSA表达水平降低。Gli抑制剂显著下调前列腺癌细胞中AR和PSA基因的表达;Hh激活剂可恢复SMO下调所导致的AR和PSA基因表达减低。说明Hh信号通路参与AR信号通路活性及AR基因表达的调控。7.Gli1过表达上调AR通路活性和AR基因表达cDNA-Gli1质粒分别转染sh-SMO细胞和sh-NC细胞,结果显示,Gli1可上调sh-SMO组PSA和AR表达,而对sh-NC组PSA和AR表达水平无影响。说明Gli1作为SMO的下游基因,参与AR通路活性和AR基因表达的调节过程。8.SMO基因敲减可增强去雄状态下LNCaP中NE相关基因表达sh-SMO组与sh-NC组相比较,NE相关基因表达无显著差异。将sh-SMO组和sh-NC组细胞连续去雄培养,发现两组细胞中SYP和CHGA蛋白均随着去雄时间的延长而表达升高,并且sh-SMO组升高程度较sh-NC组明显增强。9.SMO表达降低对LNCaP细胞增殖和迁移活性无明显影响sh-SMO组与sh-NC组相比较,CCK-8实验和细胞划痕结果均无明显差异。体外实验结果提示,SMO基因对LNCaP细胞增殖和迁移活性无明显影响。结论SMO在NEPC中特异性低表达,免疫组化方法检测SMO可协助临床诊断NEPC。SMO在AdPC向NEPC转化过程中发挥抑制作用,SMO通过Gli1调节AR通路活性和AR基因表达,SMO缺失与其他促转化因素一起可协同促进AdPC向NEPC转化。