论文部分内容阅读
【目的】
角质形成细胞(Keratinocytes, KC)在银屑病中(Psoriasis, PS)表现为过度的异常增殖和角化不全，同时p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)的活性升高。p38α信号通路主要参与调控炎症反应，并与细胞增殖、凋亡、细胞周期的调节等密切相关。KC中的p38α信号通路如何调节银屑病发病的机制目前尚不清楚。本课题使用咪喹莫特(Imiquimod, IMQ)在野生型小鼠(Wildtype,WT)和角质形成细胞中特异性敲除p38α(p38α△KC)的小鼠诱导出银屑病样皮肤炎症模型。研究KC中p38?信号通路在银屑病样皮肤炎症发病过程中调控KC的增殖及其调控机制。
【方法】
1.野生型小鼠随机分成两组，在其中一组小鼠耳朵的背侧和腹侧皮肤各涂抹25mg的凡士林(Cream)作为对照组，另一组在小鼠耳朵的背侧和腹侧皮肤各涂抹25mg的IMQ以诱导银屑病样皮肤炎症作为实验组。用游标卡尺测量耳朵厚度变化，HE观察组织病理学改变，流式细胞术检测CD45+炎性细胞浸润情况，WesternBlotting、流式细胞术和组织免疫荧光检测角质形成细胞中p38α的磷酸化水平，采用荧光定量PCR检测银屑病相关细胞因子、趋化因子以及抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)家族和Mapk14的表达情况。
2.制备角质形成细胞特异性敲除p38α(p38α△KC)的小鼠，分选出小鼠耳朵中CD45-的角质形成细胞，用荧光定量PCR和WesternBlot检测Mapk14的表达水平，分别获取WT和p38α△KC新生小鼠的KC进行体外培养，通过IL-17A刺激1天后，用EdU实验和MTT实验检测KC中缺失p38α对细胞增殖能力的影响。通过细胞划痕实验研究缺失p38α对角质形成细胞迁移和损伤修复的影响。
3.用IMQ诱导WT和p38α△KC小鼠银屑病样皮肤炎症疾病模型，测量小鼠耳朵厚度变化，HE染色镜检进行组织病理学检测，荧光定量PCR检测两组小鼠耳朵组织中细胞因子、趋化因子以及抗菌肽家族基因的表达水平变化。用流式细胞术和免疫组织化学染色检测Ki67表达水平。流式细胞术检测分析耳朵引流淋巴结中树突状细胞(Dendriticcells,DC)活化和T细胞的分化发育情况，以及炎性细胞分布情况差异。
4.分别获取WT和p38α△KC新生小鼠的皮肤KC体外培养，通过IL-17A刺激不同时间点后，WesternBlotting检测相关蛋白的变化情况，细胞免疫共聚焦检测IL-17A刺激后p-Stat3(Ser727)蛋白在角质形成细胞中的磷酸化水平，以及银屑病相关基因的表达情况。同时通过IMQ诱导WT和p38α△KC小鼠银屑病样皮肤炎症，观察组织中p-Stat3(Ser727)蛋白的表达分布情况。
【结果】
1.IMQ涂抹WT小鼠耳朵三天后，小鼠耳朵厚度增加、明显肉眼可见的的红斑，银白色鳞屑，血管生成，组织病理学上表现为明显的角质形成细胞细胞的异常增生，以及大量炎性细胞的浸润，银屑病相关的细胞因子和趋化因子表达升高。同时，角质形成细胞细胞中的p38α的磷酸化水平增高，而表达p38α的Mapk14基因和总p38α水平则没有变化。
2.体外实验结果显示，在IL-17A刺激1天后，相比于WT，在KC中特异性缺失p38α后，在新生p38α△KC中小鼠获取KC的增殖能力降低，同时抑制p38α后KC的迁移和损伤修复能力。
3.p38α△KC改善IMQ诱导的小鼠银屑病模型，表现为小鼠耳朵厚度相对WT减轻，病损皮肤中KC的增殖能力受到抑制，同时,银屑病相关的趋化因子以及细胞因子的表达水平降低。而炎性细胞浸润基本不受影响，耳后引流淋巴结中DC分子活化、T细胞分化发育以及各种炎性细胞的分布则不受影响。
4.在IMQ诱导的WT小鼠耳朵银屑病样皮肤炎症中，组织中的NF-κBp65的磷酸化水平，以及Stat3蛋白的Stat3(Tyr705)和Stat3(Ser727)两个位点的磷酸化水平均升高；在KC中特异性敲除p38?以后，p-Stat3(Ser727)和p-NF-κBp65的水平降低。同时，一些银屑病相关的细胞因子和趋化因子的表达水平降低。
【结论】
IMQ诱导的小鼠银屑病疾病模型中角质形成细胞中p38α的磷酸化水平升高，p38α可以通过调节NF-κBp65信号通路改变免疫微环境，并通过STAT3信号通路来促进角质形成细胞的增殖能力，从而加强小鼠银屑病样皮肤炎症的发病程度，抑制p38α的活性有望成为治疗银屑病的新靶点。
角质形成细胞(Keratinocytes, KC)在银屑病中(Psoriasis, PS)表现为过度的异常增殖和角化不全，同时p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)的活性升高。p38α信号通路主要参与调控炎症反应，并与细胞增殖、凋亡、细胞周期的调节等密切相关。KC中的p38α信号通路如何调节银屑病发病的机制目前尚不清楚。本课题使用咪喹莫特(Imiquimod, IMQ)在野生型小鼠(Wildtype,WT)和角质形成细胞中特异性敲除p38α(p38α△KC)的小鼠诱导出银屑病样皮肤炎症模型。研究KC中p38?信号通路在银屑病样皮肤炎症发病过程中调控KC的增殖及其调控机制。
【方法】
1.野生型小鼠随机分成两组，在其中一组小鼠耳朵的背侧和腹侧皮肤各涂抹25mg的凡士林(Cream)作为对照组，另一组在小鼠耳朵的背侧和腹侧皮肤各涂抹25mg的IMQ以诱导银屑病样皮肤炎症作为实验组。用游标卡尺测量耳朵厚度变化，HE观察组织病理学改变，流式细胞术检测CD45+炎性细胞浸润情况，WesternBlotting、流式细胞术和组织免疫荧光检测角质形成细胞中p38α的磷酸化水平，采用荧光定量PCR检测银屑病相关细胞因子、趋化因子以及抗菌肽(Antimicrobial peptides,AMPs)家族和Mapk14的表达情况。
2.制备角质形成细胞特异性敲除p38α(p38α△KC)的小鼠，分选出小鼠耳朵中CD45-的角质形成细胞，用荧光定量PCR和WesternBlot检测Mapk14的表达水平，分别获取WT和p38α△KC新生小鼠的KC进行体外培养，通过IL-17A刺激1天后，用EdU实验和MTT实验检测KC中缺失p38α对细胞增殖能力的影响。通过细胞划痕实验研究缺失p38α对角质形成细胞迁移和损伤修复的影响。
3.用IMQ诱导WT和p38α△KC小鼠银屑病样皮肤炎症疾病模型，测量小鼠耳朵厚度变化，HE染色镜检进行组织病理学检测，荧光定量PCR检测两组小鼠耳朵组织中细胞因子、趋化因子以及抗菌肽家族基因的表达水平变化。用流式细胞术和免疫组织化学染色检测Ki67表达水平。流式细胞术检测分析耳朵引流淋巴结中树突状细胞(Dendriticcells,DC)活化和T细胞的分化发育情况，以及炎性细胞分布情况差异。
4.分别获取WT和p38α△KC新生小鼠的皮肤KC体外培养，通过IL-17A刺激不同时间点后，WesternBlotting检测相关蛋白的变化情况，细胞免疫共聚焦检测IL-17A刺激后p-Stat3(Ser727)蛋白在角质形成细胞中的磷酸化水平，以及银屑病相关基因的表达情况。同时通过IMQ诱导WT和p38α△KC小鼠银屑病样皮肤炎症，观察组织中p-Stat3(Ser727)蛋白的表达分布情况。
【结果】
1.IMQ涂抹WT小鼠耳朵三天后，小鼠耳朵厚度增加、明显肉眼可见的的红斑，银白色鳞屑，血管生成，组织病理学上表现为明显的角质形成细胞细胞的异常增生，以及大量炎性细胞的浸润，银屑病相关的细胞因子和趋化因子表达升高。同时，角质形成细胞细胞中的p38α的磷酸化水平增高，而表达p38α的Mapk14基因和总p38α水平则没有变化。
2.体外实验结果显示，在IL-17A刺激1天后，相比于WT，在KC中特异性缺失p38α后，在新生p38α△KC中小鼠获取KC的增殖能力降低，同时抑制p38α后KC的迁移和损伤修复能力。
3.p38α△KC改善IMQ诱导的小鼠银屑病模型，表现为小鼠耳朵厚度相对WT减轻，病损皮肤中KC的增殖能力受到抑制，同时,银屑病相关的趋化因子以及细胞因子的表达水平降低。而炎性细胞浸润基本不受影响，耳后引流淋巴结中DC分子活化、T细胞分化发育以及各种炎性细胞的分布则不受影响。
4.在IMQ诱导的WT小鼠耳朵银屑病样皮肤炎症中，组织中的NF-κBp65的磷酸化水平，以及Stat3蛋白的Stat3(Tyr705)和Stat3(Ser727)两个位点的磷酸化水平均升高；在KC中特异性敲除p38?以后，p-Stat3(Ser727)和p-NF-κBp65的水平降低。同时，一些银屑病相关的细胞因子和趋化因子的表达水平降低。
【结论】
IMQ诱导的小鼠银屑病疾病模型中角质形成细胞中p38α的磷酸化水平升高，p38α可以通过调节NF-κBp65信号通路改变免疫微环境，并通过STAT3信号通路来促进角质形成细胞的增殖能力，从而加强小鼠银屑病样皮肤炎症的发病程度，抑制p38α的活性有望成为治疗银屑病的新靶点。