背景：根据肿瘤干细胞学说,肿瘤干细胞是导致肿瘤发生、侵袭、转移及常规放化疗抵抗的根源,已有多个研究表明肿瘤干细胞表现出较普通肿瘤细胞更强的辐射抵抗能力[1-5]。尽管当前可以利用肿瘤干细胞特异性表面标记[6]或者干细胞自身特性(Hoechest33342排染能力)[7]进行流式细胞仪分选肿瘤干细胞,然而,仪器分选过程的损伤及Hoechest 33342染料对细胞的毒性作用均不利于后续的研究。含生长因子的无血清悬浮培养可以维持细胞的未分化状态,在此条件下,相对未分化的肿瘤细胞能存活且增殖形成细胞球,而大部分分化的肿瘤细胞因不能耐受无血清培养而出现凋亡,这正是无血清悬浮培养被用于富集乳腺癌干细胞的理论基础。然而无血清悬浮培养的微球囊只能初步富集肿瘤干细胞。悬浮培养的乳腺癌细胞微球囊中仅有部分细胞具有自我更新能力,因此球囊细胞存在不均一性,其富集程度不足以纯化乳腺癌干细胞。基于乳腺癌干细胞的辐射抵抗及无血清培养能富集致瘤性干细胞的理论,我们利用悬浮球培养联合不同的辐射照射模式,以求高度纯化人乳腺癌细胞株MCF7中辐射抵抗的CD44+/CD24-/low乳腺癌干细胞并初步研究其辐射抵抗机制。目的：1)探讨悬浮球培养联合不同的辐射照射模式获得高度纯化乳腺癌干细胞的可行性。2)探讨纯化后球囊细胞的辐射抵抗特性。2)探讨悬浮球囊细胞用作乳腺癌干细胞辐射抵抗研究模型的可靠性。材料与方法：1)乳腺癌微球囊的培养：MCF-7细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培养。悬浮球培养的MCF-7细胞重悬于含生长因子的无血清DMEM/F12培养基,孵育于37℃、5%CO2培养箱中,待微球囊球形成后,收集并制为单细胞悬液,以一定的克隆密度连续传代。第二代微球囊经照射后第3天,离心收集微球囊,重悬于新鲜培养基,每3天一次,连续两次后将细胞制成单细胞悬液以适当密度传代。待新的微球囊形成后,悬液经400目滤网过滤,收集未通过滤网的微球囊,消化成单细胞悬液,重新以克隆密度培养于无血清培养体系,每隔一周传代一次。2)CD44+/CD24-/low细胞比例的检测检测无血清培养第1、2、3、4、5及7天,第1、3、5、7及10代,照射后第1、3、5代微球细胞,机械吹打为单细胞悬液,以PBS调整细胞密度为每管1×106/100μl。设实验组和同型对照组。实验组加入CD44-FITC和CD24-PE标记的单克隆抗体,对照组加入相应的同型对照抗体,4℃避光温育,30min后加5mlPBS漂洗去除未结合的抗体,1小时内用流式细胞仪检测,常规检测三次。3)细胞照射采用Varian2100C直线加速器6 MVX线为放射源,源皮距照射,剂量率300cGy/min,SSD=100 cm,PDD=80%,照射野100 mm×100mm,按8Gy单剂量组与2Gy×4次分割照射组(8Gy组以第1天8Gy一次照射；2Gy×4次组以第1、2、3、及4天照射,2Gy/次,1次/天)；按0,2,4,6,8Gy的剂量组给予照射用于描绘剂量存活曲线；采用2Gy照射与0Gy假照射,检测24小时后细胞凋亡及细胞周期。4)台盼蓝拒染实验制备单细胞悬液。并作适当稀释(106细胞/ml),取900μl细胞悬液移入试管中,加100μl 0.4%台盼蓝溶液,混匀。用血球计数板在显微镜下观察并计算细胞存活率。5)小鼠体内成瘤实验收集贴壁培养、微球囊细胞及纯化后细胞,分别制成单细胞悬液,重悬于DMEM/F12:matrigel (1:1)混合液,细胞悬液皮下注射于4周龄雌性NOD/SCID小鼠的胁腹部,注射体积为100ul,接种细胞数量分别为1×106cells/只,2×104cells/只,2×103cells/只。每只小鼠同时大腿肌注0.05mg17β雌二醇,每周注射一次。6)细胞凋亡与细胞周期检测普通MCF7及2Gy×4次辐射纯化后微球囊细胞,经2Gy照射或0Gy假照射24小时后收集细胞,以不含EDTA的胰酶消化(普通MCF7)或巴氏吸管轻轻机械吹打(微球囊细胞)至单细胞悬液,以buffer调整细胞密度1×106/500μl,加入5μl Annexin V F ITC和5μl P I,室温避光温育15 min后上流式细胞仪检测。将细胞制成单细胞悬液,计数每份标本细胞量达1×106,离心后去上清液,加入-20℃预冷的70%乙醇固定,上机前离心去上清液,加入5mlPBS室温下水化15min,再次离心去上清,加细胞周期检测试剂,4℃避光染色30 min,上机检测细胞周期各个时相所占百分比。7)克隆形成实验将照射后的细胞置于37℃,5%CO2的孵育箱进行培养,连续培养10天。终止培养后常规以PBS缓冲液洗涤细胞2次,经甲醇固定,采用1%的结晶紫染液染色后,在显微镜下计算细胞>50个的细胞克隆数,计算克隆形成率(克隆形成率=生成的克隆数/接种细胞数×100%)和存活分数(survival fraction, SF=受照射细胞的克隆形成率/对照组细胞克隆形成率×100%)。8)放射生物学参数及剂量存活曲线对3次照射的存活分数的平均数进行分析,运用GraphPad Prism 5.0软件进行单击多靶模型曲线拟合。根据单击多靶模型求出D0、Dq及N,其中logN=Dq/DO。9)细胞内活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平检测收集单层培养细胞或纯化后的球囊细胞,以1×106cells/ml的浓度重悬于DCFH-DA的稀释液(10μMDCFH-DA溶解于1L RPMI 1640),37℃细胞培养箱内孵育20分钟。每隔3-5分钟颠倒混匀一下,使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞三次,以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA,一小时内用流式细胞仪检测细胞内活性氧浓度。等体积不含DCFH-DA的RPMI 1640被用作阴性对照,加50μg Rosup用作阳性对照。10) ATM基因表达的测定分别收集贴壁细胞或球囊细胞,提取RNA,逆转录成cDNA,基于ABI Prism 7500系列检测系统,使用ABI公司SYBR Green试剂盒进行实时荧光定量PCR。11)统计学方法实验结果应用用SPSS 13.0软件,以独立样本t检验、单向方差分析(One-Way ANOVA及Bonferroni多重比较方法进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。义。结果1)无血清悬浮培养富含CD44+/CD24-/low细胞MCF-7细胞能在无血清的悬浮培养基中形成球囊。随着悬浮球培养时间的增加,CD44+/CD24-/low细胞含量逐渐增加,第5天时CD44+/CD24-/low细胞比例达(77.53±5.98)%。经传代处理(约每周传代一次),随着传代次数的增加,CD44+/CD24-/low细胞的含量并无显著增加,第5代时到达到峰值(79.40±3.40)%,其后含量略出现下降。2)X线照射对悬浮培养细胞的作用球囊细胞经8Gy照射后第3天,在显微镜下可见球囊细胞内颗粒明显增多。第5天见大量体积变小、变形的凋亡细胞,其间有少量肿胀细胞,呈空泡样改变。第5天进行台盼蓝染色,显微镜下观察到大量蓝染的死细胞,散在拒染细胞,其间可见拒染的空泡细胞。2Gy×4次分割照射组照射后出现相似的细胞形态学改变。单次8Gy或2Gy×4次照射后存活细胞形成的微球囊所含CD44+/CD24-/low细胞的比例均显著增加,分别为(93.57±2.81)%和(98.50±1.08)%,均显著高于单纯悬浮培养时的第5代球囊(此时含量最高),P未照射组v8Gy组=0.002,P未照射组v2Gy/4次组=0.000,不同照射模式之间含量的差异无统计学意义(P=0.182)(表1),连续5次传代后,CD44+/CD24"/low细胞的含量并未出现明显降低。3)纯化后(2Gy×4次照射)球囊细胞的辐射反应为了更客观地放映细胞对辐射的反应,减少生长因子的辐射保护作用给结果带来的差异,贴壁细胞在照射前加同等浓度的EGF、bFGF、B27及BSA孵育1小时。经2Gy照射24小时后,贴壁细胞早期凋亡率为(12.00±1.75)%,纯化后细胞的早期凋亡率为(6.40±0.44)%,纯化细胞凋亡率显著低于贴壁细胞的凋亡率(P=0.006)。细胞周期检测结果显示,纯化后球囊细胞经2Gy照射后24小时出现较显著的G2期阻滞,而贴壁培养的MCF7细胞照射后仅出现少量G2期阻滞。4)纯化后球囊细胞剂量存活曲线纯化后(2Gy×4次照射)球囊细胞及贴壁培养的MCF7细胞经0、2、4、6、8Gy五个剂量照射后,培养10天,计算出各剂量组的细胞克隆形成率和细胞存活分数,数据经Prism 5.0软件处理,进行单击多靶模型曲线拟合,拟合曲线见图6,拟合后纯化球囊细胞的Dq值为1.17±0.38,贴壁细胞的Dq值为0.65±0.07,两者有显著差异(t=-3.663,P=0.022)。5)细胞内活性氧水平测定为了进一步了解介导乳腺癌干细胞辐射抵抗的可能机制,我们分析了不同细胞的细胞内活性氧水平。我们的结果同样显示活性氧水平与细胞的辐射抵抗性相关,纯化球囊细胞的平均活性氧水平显著低于贴壁细胞(t=6.305,P=0.003);特别的是,在辐射抵抗的球囊细胞中含有高比例的低活性氧细胞群,两者之间有统计学差异(t=-32.125,P=0.000)。6)ATM基因在不同细胞中的表达实时定量RT-PCR检测球囊细胞及贴壁细胞内ATM基因的表达水平。我们的结果显示,AMT基因在球囊细胞中表达增加,而在贴壁细胞中表达相对下降,在两者中的表达存在统计学差异(t=-4.97,p=0.008)结论：辐射联合悬浮球培养进一步纯化辐射抵抗的CD44+/CD24-/low乳腺癌干细胞的方法是可行的。