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【背景与目的】人脐带华尔通氏胶来源的间质细胞具有向三个胚层的细胞分化的能力。我们课题组致力于研究人脐带间充质干细胞(human umbilicalcord mesenchymal stem cells,HUMSCs)的多能性和分化能力,目前已经成功分化为神经样细胞、心肌样细胞、精原样细胞和胰岛样细胞,表达部分标记并具有一定功能,但这些细胞并不具备完整的功能。我们猜测,由HUMSCs诱导产生的细胞分化不彻底,可能与甲基化有关系。DNA甲基化在细胞分化、发育、疾病尤其是癌症等方面都扮演着重要的角色。在细胞的分化发育过程中,干细胞标记(stem cell marker,SCM)基因的甲基化程度逐渐升高,干细胞的表达逐渐沉默,细胞的多能性逐渐降低,从而使细胞特异地向某个方向分化,因此SCM基因的DNA甲基化程度可作为干细胞分化程度的有效指示。干细胞标记Oct4-3和Oct4-7都有48个CpG位点,可以用亚硫酸氢盐测序法(bisulfitegenomic sequencing PCR,BSP)检测其甲基化状态。据此,我们拟采用BSP检测HUMSCs的干细胞标记Oct4-3和Oct4-7的甲基化程度,以了解其干细胞稳定性和分化状态,为建立功能稳定的成体细胞提供基础,为更好地调控细胞分化提供理论依据。 【材料与方法】采用差异贴壁法分离、培养、扩增出HUMSCs,RT-PCR及流式细胞术检测干细胞相关标记表达情况,快速提取法提取细胞DNA,用EZDNAMethylation-GoldKit试剂盒转化DNA样本。将PCR产物电泳跑胶,挑选跑胶条带最明显的未纯化PCR反应液进行测序,测序后将结果与源启动序列进行对比,通过BiQAnalyzer软件分析甲基化程度及甲基化位点。 【结果】HUMSCs具有多能干细胞的生物学特性,表达多能干细胞标记Oct4;测序结果反馈HUMSCs在Oct4-3的48个CpG位点中,共有四个发生甲基化,分别位于第8、30、40、44号CpG上,平均甲基化率为8.33％。在Oct4-7的48个CpG位点中,共有四个发生甲基化,分别位于第35、40、41、44号CpG上,平均甲基化率为8.33%。 【结论】亚硫酸氢盐测序法是一种简便有效的检测细胞甲基化程度的方法。Oct4的甲基化程度可作为衡量细胞分化程度的指标之一。HUMSCs具有多能干细胞特性,理论上具有发育为三个胚层细胞的能力,其分化能力与人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESc)相比无显著差异,说明HUMSCs具有进一步分化的能力。之所以HUMSCs诱导产生的细胞无法完整地表达功能,可能与HUMSCs研究还处于起步阶段以及SCM基因的甲基化程度有关,可以通过将Oct4去甲基化或者利用病毒诱导获得iPS细胞的方法,降低Oct4甲基化程度,提高HUMSCs的分化能力。但仅检测Oct4-3和Oct4-7是不够的,我们还需要进一步实验获得更多数据。