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目的评价黄连-大黄-肉桂复方及其组分配伍对肝癌小鼠证候的影响,以及对肝癌小鼠肿瘤生长和人肝癌细胞增殖的抑制作用,并从自噬的角度探索两者发挥抗肝癌作用的机制。方法1.第一部分:通过文献检索、整理和归纳分析,从理论上探讨肝癌小鼠证候模型的复制方法,总结其优缺点,从是否符合中医辨证思维和疾病发展规律等角度评价出较佳的肝癌小鼠证候模型复制方法,在此基础上开展第二部分中药改善肝癌小鼠证候的疗效评价研究。2.第二部分:右腋下皮下注射人肝癌SMMC-7721细胞建立移植瘤裸鼠肝癌模型,将成模裸鼠分为模型对照组（对照组）、黄连-大黄-肉桂复方组（复方组）和小檗碱-大黄素-桂皮醛组分配伍组（组分组）,各组给予对应的药物治疗2周。给药期间观察小鼠的状态,并于治疗前后采用小鼠计量化四诊和辨证方法,检测小鼠的气、血、阴、阳、邪毒盛衰度情况,以评价复方及其组分配伍对小鼠证候的影响。最后处死小鼠取瘤体称重,计算抑瘤率,采用蛋白印迹法检测肿瘤组织自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B的表达,并分析证候与Beclin-1、LC3B的相关性。3.第三部分:体外培养肝癌SMMC-7721、Hep G2及Huh7细胞,采用MTT法确定黄连-大黄-肉桂复方及其组分配伍抑制肝癌细胞增殖的较佳浓度,作为之后分组用药的浓度;三种肝癌细胞同步设立对照组、复方组、组分组,分别给予相应药物处理24h后,观察细胞形态及数量变化,采用溶酶体荧光探针染色法观察细胞内溶酶体生成情况;蛋白免疫印迹法检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B及P62的表达;免疫组织化学荧光法观察细胞内LC3B蛋白分布及表达;自噬双标质粒转染后观察自噬流;透射电镜观察自噬体的形成。结果1.第一部分:不同的肝癌病证结合小鼠模型各有优缺点,其中以肝癌小鼠自发形成证候最符合中医辨证思维和疾病发展规律,是开展中医辨证论治疗效评价研究的理想模型,SMMC-7721肝癌小鼠模型证候以邪毒壅盛实证为主,以此用于本论文第二部分的研究。2.第二部分:（1）证候变化及药物寒热属性评价:与对照组比较,用药后的肝癌小鼠邪盛程度降低,气、血盛衰度均有所改善,以复方的作用更佳;而阴、阳盛衰度变化不明显,反证药物的寒热属性平缓,使肿瘤小鼠阴阳平衡,维持机体趋于寒热平稳。（2）抑制肿瘤作用:复方与组分均有抑瘤作用,各组小鼠瘤体积随时间增大,用药组的增长幅度明显低于对照组,瘤重结果与瘤体积变化趋势一致。（3）自噬分子的变化及其与证候的关联:与对照组比较,药物对肝癌组织Beclin-1的表达几乎没有作用,却能明显升高LC3B-II/LC3B-I的比值,且其与血盛衰度和阳盛衰度呈显著正相关性。3.第三部分:（1）对肝癌细胞增殖的抑制作用,复方的较佳浓度为0.86 mg/m L,组分的最佳配伍为小檗碱44μmol/L、大黄素23μmol/L和桂皮醛46μmol/L。（2）复方及组分能明显增加SMMC-7721及Huh7细胞内的溶酶体数量,对Hep G2仅有增加的趋势。（3）复方及其组分对三种肝癌细胞Beclin-1的表达几乎无影响,仅复方使Hep G2细胞的Beclin-1表达明显升高;两药可使Hep G2和Huh7细胞的LC3B-II/I比值和P62表达明显升高,却使SMMC-7721的P62表达明显降低的同时,并不影响其LC3B-II/I的比值。（4）复方与组分均能增加三种肝癌细胞内LC3B的荧光颗粒,且复方的作用优于组分。（5）复方及组分有促使SMMC-7721细胞自噬流打开的趋势,但对Hep G2细胞的影响不大。另外组分能明显促进Huh7细胞自噬流的打开,但复方却无此功能。（6）复方及组分作用后,SMMC-7721细胞内自噬体及自噬溶酶体数量明显增多,而Hep G2细胞内仅有自噬体的堆积,并未见自噬溶酶体的增加;另外,组分能使Huh7细胞内自噬体和自噬溶酶体均增加,而复方组仅见细胞内自噬体的堆积。结论1.在肝癌疾病小鼠模型基础上,不叠加任何其他证候造模方法,而是让小鼠自发形成证候,这是既能体现中医辨证思维又能模拟疾病变化的理想肝癌病证结合模型,是开展肝癌证候研究、辨证论治疗效及药性药味评价的理想模型。2.黄连-大黄-肉桂复方及其组分配伍可使肝癌移植瘤小鼠的邪盛程度有所降低,阴阳趋于平稳的同时,气、血盛衰度均有所改善,反证药物不仅寒热属性平和,且能促进气血的提升,有助于改善机体的整体状态,增强抗病能力。3.黄连-大黄-肉桂复方及其组分配伍均能有效抑制肝癌小鼠肿瘤的生长,也能体外抑制三种肝癌细胞的增殖,具有较好的抗肝癌作用,具有较好的应用前景。4.黄连-大黄-肉桂复方及其组分配伍可促进SMMC-7721细胞发生自噬,却能抑制Hep G2细胞的自噬;而在Huh7细胞,复方抑制了自噬的发生,组分却促进其自噬的发生。这种均能抑制不同肝癌细胞增殖,却对其自噬调节存在正、反差异的现象,可能与所采用的肝癌细胞株之间存在异质性有关,这也与中药个体辨证,常发挥双向调节的特点是一致的。