【摘 要】
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目的:脑卒中是在世界范围导致死亡和成人残疾的主要原因之一,主要分为缺血性和出血性两大类。我国最常见的卒中亚型是缺血性卒中,但目前对其治疗方法非常有限。环黄芪醇(Cycloastragenol,CAG)是从黄芪中分离提取的一种次生代谢产物,具有多种药理学作用。研究表明,环黄芪醇能够激活端粒酶、调节免疫力,对心血管疾病、脂肪肝、腹主动脉瘤等疾病模型均具有保护作用。本课题在小鼠脑缺血损伤模型中研究CAG
【基金项目】
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国家自然科学基金项目(81503055、81873029);
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目的:脑卒中是在世界范围导致死亡和成人残疾的主要原因之一,主要分为缺血性和出血性两大类。我国最常见的卒中亚型是缺血性卒中,但目前对其治疗方法非常有限。环黄芪醇(Cycloastragenol,CAG)是从黄芪中分离提取的一种次生代谢产物,具有多种药理学作用。研究表明,环黄芪醇能够激活端粒酶、调节免疫力,对心血管疾病、脂肪肝、腹主动脉瘤等疾病模型均具有保护作用。本课题在小鼠脑缺血损伤模型中研究CAG是否对缺血性脑卒中有神经保护作用,以及其可能的作用机制。方法:对23-26g的C57BL/6雄性小鼠进行大脑中动脉闭塞手术(middle cerebral artery occlusion,MCAO),脑梗塞45分钟后实行再灌注。将手术后的小鼠随机分为MCAO组和CAG给药(MCAO+CAG)组,其中给药组又分为低剂量(5mg/kg)、中剂量(10 mg/kg)和高剂量(20 mg/kg)三个剂量组。再灌注时腹腔注射CAG,12小时后再给药一次,接下来每日两次,直到术后第3天。假手术组(Sham)和MCAO组给予溶剂对照。在脑缺血后第1天,使用滚筒跑步机实验、神经功能评分和TTC染色分别检测CAG对MCAO小鼠神经行为功能损伤和脑梗塞体积的影响;在脑缺血后第3天,使用滚筒跑步机实验、神经功能评分和步态来评价动物的神经行为功能损伤,使用尼氏染色检测动物的脑梗塞情况。使用免疫组化来检测脑缺血后第1天和第3天的大脑缺血侧皮层的神经元的丢失;通过伊文思蓝外渗法和明胶酶谱法检测CAG对血脑屏障通透性和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-2/9活性的影响;通过Western Blot检测紧密连接蛋白(ZO-1和Occludin)、组蛋白去乙酰化酶SIRT1、乙酰化p53、凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2、核转录因子kB(NF-kB)p65和乙酰化p65(lys310)的表达水平;使用Real-time PCR检测Sirt1和炎症因子的m RNA转录水平;通过荧光法测定CAG对SIRT1酶活性的作用;通过免疫组化染色观察缺血脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的数量。结果:在脑缺血后第1天和第3天,CAG能够明显改善MCAO小鼠的神经功能和运动功能缺失,抑制缺血脑皮层神经元的丢失,减少脑梗死体积。在脑缺血后第1天,CAG能够抑制MCAO诱导的血脑屏障破坏、MMP-9的活性升高以及紧密连接蛋白ZO-1、Occludin的降解。CAG能够上调缺血脑中SIRT1的m RNA和蛋白的表达水平,但不能直接激活SIRT1的酶活性。伴随着SIRT1表达的上调,CAG明显地降低了缺血脑中p53的乙酰化水平和促凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的比值。CAG能显著抑制缺血脑内NF-kB p65向核内转移,进而降低促炎症因子TNF-α和IL-1β的m RNA转录水平。在脑缺血后第3天,CAG明显抑制了缺血脑皮层小胶质细胞和星形胶质细胞的活化。CAG能够部分地降低p65在Lys310位点的乙酰化水平,但是没有达到统计学意义。结论:我们的研究结果发现,CAG对小鼠脑缺血再灌注损伤具有显著的神经保护作用。CAG可减少MCAO小鼠缺血脑皮层神经元丢失,减轻血脑屏障的破坏,改善神经行为功能缺陷,减小脑梗死体积。而且CAG的神经保护作用在脑缺血再灌注后至少持续3天。其保护作用机制可能是CAG能够上调缺血脑区SIRT1的表达,减少p53的乙酰化,从而抑制MCAO诱导的细胞凋亡;同时,CAG能抑制NF-kB的活化和神经炎症反应。我们的研究结果为CAG对抗脑缺血损伤的神经保护作用提供了药理学研究依据,提示CAG可以作为治疗缺血性脑卒中的神经保护药物进行后续的临床前和临床研究。
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