【摘 要】
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目的:尤文肉瘤是一种多发于青少年骨及软组织的罕见恶性肿瘤,该肿瘤病程短,复发快,转移率高。EWS-ETS融合蛋白的形成是其主要始发因素,其中85%为EWS-Fli1融合蛋白。由于该融
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目的:尤文肉瘤是一种多发于青少年骨及软组织的罕见恶性肿瘤,该肿瘤病程短,复发快,转移率高。EWS-ETS融合蛋白的形成是其主要始发因素,其中85%为EWS-Fli1融合蛋白。由于该融合蛋白无固定结构,很难找到特异性靶向药物。近年,关于其表观遗传学及免疫逃逸研究方兴未艾。作为一种主要发生在儿童及青少年中的肿瘤,尤文肉瘤突变往往很少,高剂量的化疗虽然有助于肿瘤的延缓,但是往往伴随神经系统发育不全,智力相对低下,抑郁等不良后果,因此我们希望在表观遗传学方面探索该肿瘤治疗的新思路,其中UHRF1作为一种重要的表观调节子,同时参与DNA甲基化与组蛋白修饰,使两者处于动态平衡以维持细胞周期的顺利进行。本实验旨在探索UHRF1在尤文肉瘤的表达情况、功能及调控机制以期寻找新的靶向性药物,在前期实验的基础上,我们进一步探索了UHRF1的新的靶向性药物及其作用机制。研究方法:本研究首先通过免疫组化和蛋白免疫印迹检测了尤文肉瘤组织及细胞系(SK-N-MC,SK-ES-1,A673)中UHRF1的表达情况,然后用相关细胞系进行体外实验,设置对照组及实验组,分别转染Si Scr及Si UHRF1,检测细胞增殖及周期变化,提取蛋白质及m RNA检测UHRF1,DNMT1等在蛋白水平及m RNA水平变化情况;分别转染Si Scr及Si EWS-Fli1/Si Fli,探索EWS-Fli1对UHRF1及DNMT1的作用;用CX-5461作用于细胞系后,检测UHRF1及DNMT1的变化情况,在发现CX-5461可以明显降低UHRF1蛋白水平后,进一步用293T细胞作为工具细胞探索CX-5461降低UHRF1的作用机制,分别转染UHRF1+Scramble,UHRF+HA-Ubiquitin,UHRF1+HA-Ubiquitin对应质粒,用CX-5461及MG-132按次序处理,探索CX-5461是否通过泛素化途径进而使UHRF1通过蛋白酶体途径降解。结果:UHRF1蛋白在尤文肉瘤组织及细胞系中均高表达,参与细胞增殖及周期调控,可以维持尤文肉瘤中DNMT1的稳定性;EWS-Fli1可以维持UHRF1及DNMT1的稳定性;CX-5461除可以诱导尤文肉瘤自噬及G2/M期阻滞外,还可以降低UHRF1及DNMT1的蛋白水平,进一步验证了CX-5461通过促进UHRF1的泛素化而使其降解。结论:EWS-Fli1可以通过维持UHRF1蛋白稳定性维持尤文肉瘤的恶性程度;CX-5461具有作为UHRF1新的靶向性药物治疗尤文肉瘤的潜力。
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