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目的:膀胱癌是全球第十大最常见的癌症,占全球癌症死亡总人数的2.1%。其在男性和女性中的发病率分别位居第四位和第十位。根据2020年全球癌症统计数据结果显示,膀胱癌的新发病例估计约为57.3万,死亡病例约为21.2万,其中男性的发病率和死亡率约为女性的4倍。在中国膀胱癌的发病率居恶性肿瘤发病普的第十三位,男性发病率居恶性肿瘤发病普的第七位,发病率为女性的3.8倍,死亡率为女性的4倍。根据2022年中美癌症统计结果显示,中国2022年的膀胱癌新发病例和死亡病例均远高于美国。目前临床上针对膀胱癌的治疗手段主要为手术、化疗、放疗、免疫治疗以及靶向治疗等。但由于膀胱癌的不同病理特点,其经过以上手段治疗之后仍然存在着许多问题,如非肌肉浸润型的膀胱癌术后复发率较高,肌肉浸润型膀胱癌其预后很差,5年生存率较低等。因此,寻找新的毒性低且疗效好的抗膀胱癌的药物迫在眉睫。中医药治疗膀胱癌已有报道,引起了国内外的广泛关注,如丹皮酚、青蒿琥酯以及苦参等传统中医药的提取物或传统中药材均能够发挥抗膀胱癌作用。目前关于高良姜素抗肿瘤的研究已经有较多的报道,但关于高良姜素抗膀胱癌的研究几乎没有,故本研究拟通过网络药理学及体外实验来探索高良姜素抗膀胱癌的作用。方法:（一）运用网络药理学技术分析高良姜素发挥抗膀胱癌的作用机制。使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、Swiss Target Prediction数据库以及targetnet数据库预测高良姜素的作用靶点。通过Gene Cards数据库获得膀胱癌相关靶点。两者取交集,即为高良姜素抗膀胱癌的作用靶点。交集靶点利用STRING数据库以及Cytoscape3.9.0软件构建作用靶点蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络,筛选出核心作用靶点。采用在线注释及可视化整合分析工具DAVID Bioinformatics Resources（2021 Update）将核心靶点进行基因本体论（GO）功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析。利用Cytoscape 3.9.0软件构建构建药物-疾病-靶点-通路网络。（二）以人膀胱癌细胞5637,HT-1376以及正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞系为研究对象,采用CCK-8试剂盒检测不同浓度（0μM,40μM,80μM,120μM,160μM,200μM）的高良姜素处理上述细胞24小时后对膀胱癌细胞增殖的影响。（三）在网络药理学的基础上,研究p53信号通路在高良姜素抗膀胱癌中的作用。以膀胱癌细胞5637和HT-1376为研究对象,结合CCK-8实验,设置高良姜素药物浓度为0μM,120μM,160μM进行实验验证。平板克隆实验检测高良姜素对细胞增殖的影响;Hoechst 33258染色与流式细胞术检测高良姜素诱导膀胱癌细胞的凋亡情况;蛋白免疫印迹（western blot）法检测高良姜素对凋亡相关蛋白bax、Bcl-2、Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase3以及p53信号通路相关蛋白MDM2、p53、p-p53和cytc的表达的影响。si-p53沉默之后进一步验证高良姜素对膀胱癌的抑制情况。结果:（一）通过不同数据库去重之后共获得高良姜素作用靶点204个,膀胱癌靶点2912个。两者交集之后共获得高良姜素抗膀胱癌作用靶点115个。GO分析获得生物学过程（BP）101个GO项,细胞组分（CC）共富集到16个GO项,分子功能（MF）共富集到53个GO项,KEGG通路富集分析共富集到包括癌症信号通路、细胞衰老、病毒致癌、化学致癌-受体激活、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、非小细胞肺癌、前列腺癌、孕酮介导的卵母细胞成熟、细胞周期等53条信号通路。（二）随着高良姜素浓度的增加,膀胱癌细胞5637、HT-1376以及正常膀胱上皮细胞SV-HUC-1的增值率逐渐下降,在同样浓度下,高良姜素对正常膀胱上皮细胞的增殖率影响较膀胱癌细胞更小。（三）平板克隆实验显示高良姜素以浓度依赖的方式抑制膀胱癌细胞增殖;Hoechst33258染色与流式细胞术结果提示高良姜素呈浓度依赖方式诱导膀胱癌细胞凋亡;蛋白免疫印迹（Western blot）实验提示高良姜素能够呈剂量依赖的方式使凋亡相关蛋白bax、Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase3表达上调,使Bcl-2表达下调;使p53信号通路相关蛋白MDM2表达下调,p53、p-p53、cytc的表达上调。使用si RNA沉默p53蛋白后,使用高良姜素处理膀胱癌细胞,发现高良姜素能够使p53沉默后的细胞的p53蛋白表达上调,同时也能够对p53蛋白沉默的细胞增殖受到影响。结论:1.网络药理学结果提示,高良姜素能够通过多靶点多通路发挥抗膀胱癌作用,其中p53信号通路可能在高良姜素抗膀胱癌中发挥着重要作用。2.CCK-8以及平板克隆实验结果提示高良姜素能够呈剂量依赖性的方式抑制膀胱癌细胞增殖。3.体外实验提示高良姜素能够通过激活p53信号通路诱导膀胱癌细胞凋亡。