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急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）是一种常见的呼吸系统急危重症,死亡率高,目前缺乏有效的治疗手段。内皮糖萼是位于血管内皮细胞表面的多糖复合结构,它不仅是血管壁的选择性通透性屏障,还能限制血细胞与内皮细胞的接触,维持血管内皮的正常微环境。内皮糖萼的破坏会增加血管的通透性,加速肺水肿,促进急性肺损伤的发生与发展。在研究中,我们创新性地提出了以硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate,HS）为修复材料,将其种植在内皮糖萼缺损部位的内皮细胞膜上,以修复内皮糖萼的策略。首先,制备E-选择素结合肽（E-selectin-binding peptides,EBP）修饰并加载四嗪（Tetrazines,Tz）的膜融合脂质体（Fusion liposomes,FLs）,利用EBP对炎症刺激的内皮细胞表面高表达的E-选择素的靶向性,将Tz锚定到内皮细胞膜上,然后注入反式环辛烯（Trans cyclooctene,TCO）修饰的HS。随后,Tz和TCO之间的生物正交反应可以将HS固定在内皮细胞膜上,从而修复内皮糖萼。并以急性肺损伤为疾病模型,阐明该给药系统如何修复内皮糖萼,为靶向修复内皮糖萼的新型药物制剂的研究和临床应用提供理论和实验依据。本研究主要包括以下6部分内容:1.材料合成及结构鉴定通过E-选择素结合肽（E-selectin binding peptide,EBP）上的巯基与马来酰亚胺-聚乙二醇-二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（Maleimide-polyethylene glycol-dimethyl myristoyl phosphatidylethanolamine,DMPE-PEG-MAL）上的马来酰亚胺基团（Maleimide,MAL）发生加成反应,合成了能与E-选择素特异性结合的靶向脂质材料EBP-PEG-DMPE。其次,Tz与二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（Dimyristoylphosphatidylethanolamine,DMPE）通过酰化反应共价连接,合成锚定材料Tz-DMPE。最后,通过N-羟基琥珀酰亚胺活性酯（N-hydroxysuccinimide,NHS）参与的酰化反应,在HS上修饰TCO,合成了糖萼修复材料TCO-HS。2.EBP-Tz-FLs处方工艺优化和理化性质表征采用薄膜分散法制备膜融合脂质体EBP-Tz-FLs。研究了（2,3-二油酰基-丙基）-三甲基氯化铵（（2,3-dioloyl-propyl）-trimethylammonium chloride,DOTAP）含量、EBP-PEG-DMPE/Tz-DMPE质量比、超声时间、超声功率和水化体积对EBP-Tz-FLs粒径、电位及细胞摄取的影响。最终确定20%DOTAP、EBP-PEG-DMPE/Tz-DMPE质量比为5:4时是EBP-Tz-FLs的最佳处方,超声功率390 W、超声时间7 min、水化体积10 m L是制备EBP-Tz-FLs的最佳处方工艺。制备得到的EBP-Tz-FLs粒径为122.80±5.00 nm且分布均匀,电位为42.25±3.67 m V。透射电镜的结果显示EBP-Tz-FLs呈圆形的脂质体样结构,稳定性实验表明EBP-Tz-FLs在4℃下具有较好的稳定性。3.EBP-Tz-FLs和TCO-Cy5体外细胞学研究首先考察了温度以及能量抑制剂叠氮化钠（NaN3）对EBP-Tz-FLs细胞摄取的影响,并利用荧光显微镜观察了与HUVECs孵育不同时间下EBP-Tz-FLs在细胞内的分布情况,实验表明EBP-Tz-FLs有较好的膜融合能力。利用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）构建细胞炎症模型,并提前给予E-选择素结合肽竞争性结合E-选择素位点。结果说明:E-选择素结合肽的修饰使得EBP-Tz-FLs具有E-选择素靶向性。EBP的修饰能够将载有Tz的脂质体靶向递送至肺内皮细胞糖萼破损的部位,再给予TCO-Cy5,利用激光共聚焦和细胞流式分析仪测定TCO-Cy5的荧光强度,发现在给予EBP-Tz-FLs后有更多的TCO-Cy5能够修饰到HUVECs上。进一步,利用多功能酶标仪检测了细胞膜上TCO-Cy5的荧光强度,实验结果证明EBP-Tz-FLs+TCO-Cy5组在细胞膜上的分布最多。4.EBP-Tz-FLs和TCO-Cy5体内组织分布首先利用LPS滴鼻法成功构建了急性肺损伤小鼠模型。将DID标记的EBP-Tz-FLs（EBP-Tz-FLs@DID）静脉注射入急性肺损伤小鼠体内,在各个时间点下其在肺部的荧光强度强于没有EBP肽修饰的膜融合脂质体。结果表明EBP肽的修饰能够使膜融合脂质体靶向至急性肺损伤小鼠的肺组织。随后,先将EBP-Tz-FLs尾静脉注射入血,1 h后将TCO-Cy5注射入小鼠体内。结果显示EBP-Tz-FLs+TCO-Cy5在实验的整个过程中,都较其他组更多地分布在肺组织中,且持续时间更长。5.评估EBP-Tz-FLs+TCO-HS对糖萼的修复以及急性肺损伤的治疗效果利用LPS构建炎症刺激后的内皮细胞模型,给药后用FITC标记的麦胚凝集素（FITC labelled wheat germ agglutinin,FITC-WGA）来标记内皮糖萼,EBP-Tz-FLs+TCO-HS组有最强的FITC-WGA荧光强度,说明EBP-Tz-FLs+TCO-HS可以较好地修复内皮糖萼。之后,运用FITC标记的白蛋白（FITC labelled bovine serum albumin,FITC-BSA）来检测该系统对HUVECs细胞通透性的影响,EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够较好地改善内皮细胞的通透性。最后,利用羧荧光素二乙酸酯-琥珀酰亚胺酯（Carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester,CFDA-SE）标记白细胞,考察白细胞对内皮细胞的粘附作用,试验发现EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够减少白细胞的粘附。在小鼠体内时,肺组织冰冻切片利用AF680标记的血小板-内皮细胞粘附分子抗体（AF680 labelled platelet endothelial cell adhesion molecule-1 antibody,AF680-CD31抗体）标记内皮血管,FITC-WGA标记糖萼,荧光成像看出,EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够修复肺内皮糖萼。进一步,考察证明EBP-Tz-FLs+TCO-HS能够改善肺血管的渗透性。在急性肺损伤治疗作用的研究中,无论是离体肺组织水肿情况、肺湿干重比、肺组织匀浆液中TNF-α水平、肺组织H＆E染色结果、急性肺损伤小鼠存活率,还是肺泡灌洗液中总蛋白浓度及细胞学分析,都表明EBP-Tz-FLs+TCO-HS具有良好的治疗急性肺损伤的能力。6.EBP-Tz-FLs和TCO-HS的体内外安全性EBP-Tz-FLs制剂无溶剂残留,EBP-Tz-FLs和TCO-HS的体外溶血百分率符合临床要求。三种材料:EBP-PEG-DMPE、Tz-DMPE以及TCO-HS,在0-160μg/m L的浓度时细胞存活率均大于70%。正常小鼠连续静脉注射EBP-Tz-FLs+TCO-HS四天,在整个给药周期中,小鼠体重无显著变化,各个脏器未见明显的病理学变化,血常规及生化指标都与生理盐水（Saline）组相似。以上结果表明EBP-Tz-FLs+TCO-HS的体内外安全性较高。研究结果显示,EBP修饰的膜融合脂质体可以实现良好的肺部靶向性,装载Tz的膜融合脂质体能够与TCO发生生物正交反应,进一步将HS靶向递送至糖萼受损的部位,起到更好地治疗效果。并且,EBP-Tz-FLs+TCO-HS具有较好的安全性。这些结果表明,这种两步靶向递送系统可以有效增加HS修饰到糖萼受损部位的含量,可作为有效调节纳米载体体外和体内行为的有前景的工具。