【摘 要】
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目的:探讨齐墩果酸（Oleanolicacid,OA）对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞外基质相关蛋白表达的影响及作用机制。方法:通过细胞复苏,传代和冻存等细胞培养方法培养购自ATCC公司的人瘢痕疙瘩成纤维细胞株。取处于对数生长期6～10代的瘢痕疙瘩成纤维细胞用于实验。采用MTT法观察OA在不同浓度（5、10、20、40、80 μg/ml）及时间梯度（12、24、48 h）下对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能
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目的:探讨齐墩果酸（Oleanolicacid,OA）对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞外基质相关蛋白表达的影响及作用机制。方法:通过细胞复苏,传代和冻存等细胞培养方法培养购自ATCC公司的人瘢痕疙瘩成纤维细胞株。取处于对数生长期6～10代的瘢痕疙瘩成纤维细胞用于实验。采用MTT法观察OA在不同浓度（5、10、20、40、80 μg/ml）及时间梯度（12、24、48 h）下对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力的变化。培养结束后提取细胞总蛋白,收集细胞外液,采用免疫印迹方法检测OA对KFs内及外液中纤连蛋白（Fibronectin,FN）、Ⅰ型前胶原（Pro-collagenI）及相关蛋白基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1,MMP-1）和 α-平滑肌肌动蛋白（α-smoothmuscle actin,α-SMA）的蛋白表达水平的影响,为加强瘢痕疙瘩微环境,于培养液中加入10 ng/ml TGF-β1,采用10 ng/ml TGF-β1与OA共同培养KFs细胞24 h后,检测细胞内及外液中FN、Pro-collagen Ⅰ及相关蛋白MMP-1和α-SMA的蛋白表达水平及OA对TGF-β1诱导的Smad2和Smad3磷酸化表达的影响。结果:1.MTT法:5、10、20、40、80 μg/mlOA处理KFs 12、24、48h后,测定细胞存活率,OA抑制KFs增殖具有剂量和时间依赖性,在80μg/ml作用48 h后抑制最显著。2.免疫印迹检测:与对照组相比,OA组在KFs外液中,Pro-collagenI及 FN 蛋白表达浓度 5μg/ml 始显著降低,并呈剂量依赖性。在 KFs 内,FN蛋白表达在10 μg/ml始显著降低。Pro-collagen Ⅰ蛋白表达10μg/ml始呈逐渐降低趋势,至20 μg/ml降低最显著。MMP-1和α-SMA的蛋白表达分别在20μg/ml和10 μg/ml时增加和降低最显著。3.TGF-β1组与对照组相比,KFs外液中,TGF-β1组Pro-collagen I、FN蛋白表达均显著增加。在细胞内,TGF-β1组Pro-collagen Ⅰ、α-SMA蛋白表达显著增加,MMP-1蛋白表达显著降低。TGF-β1+OA组与TGF-β1组相比,在KFs外液中,Pro-collagen I及FN蛋白表达在10μg/ml始均显著降低。在细胞内,FN蛋白表达5μg/ml始呈逐渐降低趋势,至20μg/ml降低最显著,而Pro-collagen Ⅰ蛋白表达5μg/ml始显著降低,MMP-1蛋白表达5μg/ml始呈增加趋势,20μg/ml时增加最显著。α-SMA蛋白表达5μg/ml始呈降低趋势,20μg/ml时降低最显著。同时,OA能显著下调TGF-β1处理后的Smad2和Smad3磷酸化的表达水平。结论:OA可抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖并可能通过TGF-β/Smad通路来减少细胞外基质沉积。这些结果提示OA可能成为治疗瘢痕疙瘩的可靠药物。
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