细胞培养技术是细胞生物学研究、医学、病毒分离培养与疫苗研发等研究领域不可欠缺的常用工具。细胞系具有一定的体外增殖能力,主要包括自发永生化细胞系和癌基因转化细胞系,前者为正常细胞,但自然发生几率很低；后者的建立相对容易,但细胞的核型、表型、分化等具有不同程度的改变,而且因含癌基因、抗性基因、病毒序列等安全隐患。因此,建立不含癌基因、抗性基因和病毒序列的永生化细胞系具有很好的应用价值。端粒(telomere)是真核细胞染色体末端的特殊结构,与细胞分裂和衰老密切相关。端粒酶负责端粒的复制,由端粒RNA、端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase, TERT)与端粒酶相关蛋白组成。研究实验资料显示,导入外源TERT基因不仅可使原代细胞永生化,而且建立的永生化细胞系为正常细胞。基因导入方法主要有重组载体转染法和病毒载体转化法,前者基因转染效率较低,通常需用抗性筛选来获得稳定的细胞克隆；后者转导效率较高,但存在病毒序列等安全隐患。转座子(transposon)是细胞基因组内可移动序列,不仅可作为基因转移载体,而且基因转移效率较高,不需通过抗性筛选即可获得稳定表达的细胞克隆。本研究将转座子的基因转移高效性与TERT的细胞永生化相结合,先以猪蛋白翻译延伸因子1a(elongation factor1a, EF-1a)启动子和生长激素polyA信号,构建SB转座子载体。经用绿色荧光蛋白报告基因细胞转染试验证明,猪源EF-1a启动子能在猪细胞中有效驱动目的基因表达,其转录活性与人巨细胞病毒的强早期启动子相当；用重组转座子载体与转座酶载体共转染猪成纤维细胞,反复传代后计数荧光阳性细胞克隆,结果显示SB转座子系统能有效介导报告基因整合。然后,用RT-PCR从猪源细胞克隆TERT cDNA,插入SB转座子载体,将重组载体pTEG-TERT与转座酶载体共转染猪肾原代成纤维细胞,培养后进行细胞克隆化,利用PCR检测从10个细胞克隆中筛选到不含抗性基因等载体序列的细胞克隆,在体外已传50代以上。细胞形态学观察结果显示,永生化细胞保持原代成纤维细胞的典型形态,并有相似的生长曲线；与原代成纤维细胞相比,永生化细胞的倍增时间随传代次数增加呈变短趋势,而克隆效率呈上升趋势；细胞周期检测结果显示,永生化细胞具有正常细胞的细胞周期,但细胞增殖能力明显增强；细胞表面标志检测结果显示,永生化细胞具有成纤维细胞的典型表面标志；细胞移植试验结果显示,永生化细胞在小鼠体内不具有肿瘤细胞的克隆形成能力：病毒感染与检测试验结果显示,永生化细胞保持原代成纤维细胞对猪伪狂犬病等病毒的易感性；支原体检测结果显示,永生化细胞系无支原体污染。这些研究结果表明,本研究构建的表达猪TERT的转座子载体可用于猪细胞永生化研究,建立的猪成纤维细胞系可用于猪病毒的分离培养和疫苗制备。