【摘 要】
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目的:构建皮下异位和肝脏原位肝癌移植瘤小鼠模型,检测肝癌免疫微环境中分泌型纤维介素蛋白2（Soluble fibrinogen-like protein 2,s FGL2）对肝癌细胞表面程序性死亡配体1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）、程序性死亡配体2（Programmed cell death ligand 2,PD-L2）和CD4+T细胞、CD8+T
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目的:构建皮下异位和肝脏原位肝癌移植瘤小鼠模型,检测肝癌免疫微环境中分泌型纤维介素蛋白2（Soluble fibrinogen-like protein 2,s FGL2）对肝癌细胞表面程序性死亡配体1（Programmed cell death ligand 1,PD-L1）、程序性死亡配体2（Programmed cell death ligand 2,PD-L2）和CD4+T细胞、CD8+T细胞表面程序性死亡受体1（Programmed cell death protein 1,PD1）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（Cytotoxic T lymphocyte-associated protein 4,CTLA4）表达的影响,阐明s FGL2发挥促瘤作用的机制。方法:利用基因表达谱数据动态分析数据库（Gene expression profiling interactive analysis,GEPIA）,分析肝癌患者肝癌组织中fgl2与PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4m RNA表达的相关性。在表达FGL2的人肝癌细胞系Hep G2、HCCLM3中,通过RNA干扰技术敲降fgl2后,利用RT-q PCR和Western Blot技术检测PD-L1、PD-L2在m RNA和蛋白水平的表达变化。在C57BL/6J背景的野生型（Wide type,WT）小鼠与fgl2基因敲除(fgl2-/-)小鼠皮下或肝脏接种Hepa1-6细胞,分别建立小鼠皮下和原位肝癌模型。荷瘤14天后牺牲小鼠,分离肿瘤组织。ELISA检测各组小鼠肿瘤组织匀浆中s FGL2的浓度。流式细胞术检测各组小鼠肿瘤微环境中肝癌细胞PD-L1、PD-L2以及CD4+T细胞、CD8+T细胞PD1、CTLA-4的表达。将荷瘤小鼠随机分为四组,分别行Isotype单药、s FGL2多克隆抗体（Anti-soluble fibrinogen-like protein 2polyclonal antibody,s FGL2 p Ab）单药、PD1单克隆抗体（Anti-programmed cell death protein 1 monoclonal antibody,PD1 m Ab）单药、s FGL2 p Ab+PD1 m Ab联合用药处理后,比较各组肿瘤大小与重量。结果:GEPIA数据库分析结果显示:肝癌患者肝癌组织中fgl2与PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4在m RNA水平呈显著正相关（R分别为0.32、0.45、0.39、0.61,P值均＜0.001）。在Hep G2、HCCLM3细胞系中,敲降fgl2后,PD-L1在m RNA和蛋白水平的表达也随之下降,P值均＜0.05。在肝癌皮下瘤模型中,fgl2-/-小鼠肿瘤组织匀浆s FGL2水平极低,显著低于WT小鼠,P＜0.01。接种Hepa1-6细胞的第5、7、9、11、13天,fgl2-/-小鼠肿瘤体积均显著小于WT小鼠,P值均＜0.05。接种第14天,fgl2-/-小鼠肿瘤重量显著小于WT小鼠,P＜0.001。较之于WT小鼠,fgl2-/-小鼠肿瘤微环境中肝癌细胞PD-L1、PD-L2以及CD4+T细胞、CD8+T细胞PD1、CTLA4表达下调,P值均＜0.05。类似地,在原位肝癌模型中,fgl2-/-小鼠肿瘤匀浆s FGL2含量显著低于WT小鼠,P＜0.01。与WT小鼠相比,fgl2-/-小鼠肿瘤浸润面积明显缩小,肿瘤微环境中肝癌细胞PD-L1及CD4+T细胞、CD8+T细胞PD1、CTLA4表达下降,P值均＜0.01。抗体干预实验中,s FGL2 p Ab+PD1 m Ab联合用药组小鼠肿瘤重量（0.029±0.005 g）轻于Isotype组（0.354±0.066 g）,P＜0.01;同时轻于s FGL2 p Ab单药组（0.173±0.075 g）和PD1 m Ab单药组（0.086±0.021 g）,但差异无统计学意义。结论:分泌型FGL2通过上调肝癌细胞PD-L1和CD4+T细胞、CD8+T细胞PD1、CTLA4的表达,介导肝癌免疫逃逸,促进肝细胞肝癌进展。
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目的:本文主要探讨了肝癌组织及肝癌细胞系中高表达的长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）ENO1-AS1在肝癌中的生物学效应以及潜在调控机制,为开发和探寻肝癌诊断治疗靶点提供基础实验依据。方法:经生物信息学分析筛选出肝细胞肝癌组织中高表达的lncRNA ENO1-AS1,并通过PCR检测ENO1-AS1在细胞系中的表达。敲低或过表达肝癌细胞内ENO1-AS1后,通
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