核苷类似物在医药领域应用广泛。目前许多核苷类似物已被用于治疗癌症和病毒感染。核苷类似物可以通过化学法和酶催化法合成,N-脱氧核糖转移酶是酶催化法合成核苷类似物的重要酶之一。N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(NDT)通过转移2’-脱氧核苷中的糖基到游离的嘌呤或嘧啶上,来合成不同的2’-脱氧核苷。NDT的碱基识别范围广,可以识别多种天然和经过修饰的碱基,因此被用于多种脱氧核苷类似物的合成,如5-氮杂-2’-脱氧胞苷,5-氟-2’-脱氧尿苷,曲氟尿苷等,且合成的转化率较高。NDT对2’-脱氧核苷类底物的糖基有很强的特异性,许多抗病毒的核苷类药物在糖基2’C和3’C带有修饰,如阿糖胞苷,司他夫定,吉西他滨等,NDT催化合成这些核苷类似物的效率低,限制了NDT的应用。因此通过基因突变,改造NDT的底物特异性,增强NDT对带有糖基修饰的核苷类似物的催化活性具有重要意义。为了获得具有2’,3’-二脱氧核苷或阿拉伯糖苷活性的NDT突变体,本研究采用半理性改造的方法,通过序列比对、同源建模、软件结构分析等手段,设计了来自瑞士乳杆菌的N-脱氧核糖转移酶Ⅱ(Lh NDT)的突变位点。通过定点饱和突变构建了Lh NDT Gly10、Ala11、Leu96三个位点的饱和突变体库。本研究应用N-脱氧核糖转移酶Ⅱ-胞苷脱氨酶(NDT-CDA)双酶共表达和靛酚蓝比色法,建立了基于全细胞催化的微孔板高通量筛选体系。该体系背景小,灵敏度和准确度高,可以应用于多种有医药价值的胞苷类似物的检测,如5-氮杂-2’-脱氧胞苷,2’,3’-二脱氧胞苷,阿糖胞苷。通过突变体库筛选得到一株Gly10Ser突变体,具有2’,3’-二脱氧核苷的催化活性。2μL突变体酶液催化10 m M 2’,3’-二脱氧肌苷和15 m M胞嘧啶,在50 m M,p H 6.0的磷酸缓冲液体系中反应12 h,合成2’,3’-二脱氧胞苷的转化率是野生型NDT催化反应的5.2倍。目前,关于N-脱氧核糖转移酶突变改造的报道较少,本研究通过突变提高了Lh NDT对2’,3’-二脱氧核苷的催化活性。建立高通量筛选方法是对酶进行突变改造的限速步骤,本研究首次建立了N-脱氧核糖转移酶Ⅱ突变体的高通量筛选体系,为NDT的进一步突变和性质优化奠定了基础。