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中华绒螯蟹“颤抖病”是一种危害极大的水产病害,该病病原为中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris),螺原体侵染可导致中华绒螯蟹出现附肢颤抖症状,一直威胁着中华绒螯蟹、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)及日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)等水生甲壳动物的养殖。螺原体首先侵染宿主的血淋巴细胞,然后相继侵染宿主的肌肉和神经等其他组织,最终导致中华绒螯蟹出现附肢颤抖症状直至死亡。缺乏适应性免疫的中华绒螯蟹可以通过先天免疫系统抵抗病原的入侵,因此在应对病原体入侵的研究方面,中华绒螯蟹自身的免疫防御机制成为一个重要的研究要点。基于本课题组前期i TRAQ的研究结果,在蛋白水平上筛选到中华绒螯蟹甘露糖结合蛋白(Mannose-binding protein,EsMBP)是螺原体侵染河蟹的免疫差异蛋白。在证实EsMBP具有重要免疫功能基础上,本研究主要利用生物信息学分析、蛋白重组表达、双链RNA干扰、互作microRNA调控等技术,在个体及细胞水平上,针对EsMBP在螺原体侵染中的功能进行研究,为“颤抖病”的有效防治提供理论依据。本论文主要包括以下三个结果:1.EsMBP序列分析、基因克隆、表达模式及相关功能研究首先,通过RACE技术进行EsMBP基因序列扩增,EsMBP全长1153 bp,其开放阅读框(ORF)编码304个氨基酸。EsMBP核酸序列中含有信号肽及碳水化合物结合区域(CLECT区域),CLECT区域具有保守的由谷氨酰胺、脯氨酸、天冬氨酸构成(Gln-Pro-Asp)的糖结合位点。在中华绒螯蟹各组织中,EsMBP在血淋巴细胞中高度表达,当螺原体刺激中华绒螯蟹后,EsMBP在血淋巴细胞中的表达量显著上调,说明EsMBP可能在螺原体侵染宿主过程中起着重要的免疫作用。将EsMBP的CLECT结构域进行克隆、连接原核表达载体,成功表达EsMBPCLECT蛋白并制备有效的多克隆抗体。研究发现,EsMBP-CLECT重组蛋白能够与螺原体凝集结合,螺原体刺激中华绒螯蟹血淋巴细胞后,在蛋白水平上EsMBP的表达增加。2.EsMBP-CLECT重组蛋白、dsRNA-EsMBP干扰在螺原体侵染中华绒螯蟹过程的功能研究将EsMBP-CLECT重组蛋白注射到中华绒螯蟹体内,血淋巴细胞中酚氧化酶(PO)活性明显上升。在EsMBP-CLECT重组蛋白的参与下,螺原体侵染河蟹后,血淋巴细胞中螺原体拷贝数与对照组相比显著降低,同时中华绒螯蟹的死亡率也减少。接着利用人工转录合成的ds RNA-EsMBP注射到中华绒螯蟹体内,成功沉默EsMBP基因后,参与中华绒螯蟹先天免疫的PO活性显著降低。EsMBP基因沉默后用螺原体侵染宿主,血淋巴细胞中的螺原体拷贝数与对照组相比显著增多,同时中华绒螯蟹的死亡率也升高。以上结果进一步说明EsMBP蛋白通过影响酚氧化酶活性在中华绒螯蟹先天免疫系统中发挥作用,提高宿主抵抗螺原体侵染的能力。3.microRNA调控EsMBP基因及功能研究通过生物信息学分析预测得到EsMBP基因的两个靶向microRNA(mi R-381-5p和mi R-2-3p)。运用双荧光素酶报告基因及细胞荧光检测证实调控EsMBP基因的microRNA为mi R-381-5p。通过突变EsMBP-3’UTR区域和mi R-381-5p,确认了EsMBP-3’UTR与mi R-381-5p靶向调控。利用western blot技术观察到mi R-381-5p mimic靶向作用EsMBP-3’UTR降低了血淋巴细胞中EsMBP的表达,同时EsMBP沉默后血淋巴细胞PO活性降低。当用mi R-381-5p mimic处理细胞后,螺原体刺激血淋巴细胞发现,细胞形态沉默EsMBP后状态极差,通过CCK-8检测到血淋巴细胞活力显著降低且螺原体拷贝数增加。反之,当用mi R-381-5p inhibitor抑制mi R-381-5p后,与mi R-381-5p mimic相比,细胞形态较好,细胞活力显著升高,螺原体拷贝数也显著降低。因此mi R-381-5p与EsMBP-3’UTR靶向互作后,沉默了血淋巴细胞中的EsMBP基因,进一步降低PO活性和先天免疫,加剧螺原体对宿主的侵染。