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目的:微囊藻毒素-LR(Microcystin-LR,MCLR)是一种单环七肽肝毒素,长期低剂量摄入MCLR与肝癌等消化道肿瘤的高发有关,但其致癌作用机制不明。人谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(Glutamate-cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)主要调节谷胱甘肽的从头合成,在细胞抗氧化防御系统中发挥着重要作用,大量证据表明GCLC表达与癌症发生、发展有关。本课题组前期研究发现,MCLR诱导WRL68细胞发生恶性转化过程中,伴随着GCLC蛋白表达水平持续降低,推测GCLC的下调可能参与了MCLR诱导的肝细胞恶性转化。为此,本研究采用低剂量MCLR对正常的人肝WRL68细胞株和课题组前期构建的稳定过表达GCLC基因的WRL68细胞株进行慢性染毒,诱导细胞恶性转化,观察GCLC过表达对MCLR恶性转化细胞的氧化应激水平及恶性表型的影响,探讨GCLC在MCLR所致细胞恶性转化中的作用。方法:1.诱导细胞恶性转化。采用正常的人肝WRL68细胞株和稳定过表达GCLC基因的WRL68细胞株,设正常对照组、MCLR染毒组、空载组、空载染毒组、GCLC过表达组、GCLC过表达染毒组,采用10 nmol/L MCLR对MCLR染毒组、空载染毒组和GCLC过表达染毒组细胞进行连续染毒,每三天传代一次,使细胞始终暴露于10 nmol/L MCLR,连续培养至第25代(约11周)。正常对照组、空载组和GCLC过表达组用磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)作对照处理。采用集落形成实验评价细胞的锚定非依赖性生长的能力,采用Transwell迁移实验评价细胞的体外迁徙能力,采用Transwell侵袭实验评价细胞的体外侵袭能力。2.检测细胞GCLC蛋白表达、氧化应激水平及PP2A酶活性。用免疫印迹法(Western blot,WB)检测GCLC蛋白的表达水平。采用南京建成的商用试剂盒检测细胞的氧化应激水平:谷氨酰半胱氨酸连接酶(Glutamate-cysteine ligase,GCL)、谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-transferase,GST)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的酶活性;谷胱甘肽(Glutathione,GSH)、8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的含量。通过紫外-可见分光光度法检测630 nm波长处磷肽的含量来反映蛋白磷酸酶2A(Protein phosphatase 2A,PP2A)活性。结果:1.长期低剂量MCLR暴露对WRL68细胞生长、迁移侵袭能力的影响及GCLC过表达的干预作用(1)Western Blot结果显示,与正常对照组相比,MCLR染毒组细胞GCLC蛋白表达水平下降(P<0.05)。GCLC过表达组细胞GCLC蛋白表达水平是空载组的3.2倍(P<0.05)。与空载组相比,空载染毒组GCLC蛋白表达水平下降了25.01%(P<0.05);且GCLC过表达染毒组GCLC蛋白表达水平高于空载染毒组(P<0.05)。(2)集落形成实验结果显示,MCLR染毒组细胞的集落形成率明显高于正常对照组(P<0.05)。空载染毒组的集落形成率高于空载组(P<0.05),且GCLC过表达染毒组的集落形成率低于空载染毒组(P<0.05)。(3)Transwell迁移实验结果显示,MCLR染毒组穿透小室的细胞数量明显多于正常对照组(P<0.05)。GCLC过表达组穿透小室的细胞数量明显少于空载组(P<0.05);空载染毒组穿透小室的细胞数量明显多于空载组(P<0.05);且GCLC过表达染毒组穿透小室的细胞数量明显少于空载染毒组(P<0.05)。(4)Transwell侵袭实验结果显示,MCLR染毒组穿透Matrigel膜的细胞数量明显多于正常对照组(P<0.05)。GCLC过表达组穿过Matrigel膜的细胞数量明显少于空载组(P<0.05);空载染毒组穿过Matrigel膜的细胞数量明显多于空载组(P<0.05);且GCLC过表达染毒组穿透Matrigel膜的细胞数量明显少于空载染毒组(P<0.05)。2.长期低剂量MCLR暴露对WRL68细胞氧化应激水平和PP2A酶活性的影响及GCLC过表达的干预作用(1)GCL酶活性和GSH含量测定结果显示,与正常对照组相比,MCLR染毒组GCL酶活性和GSH含量均下降,分别降至正常对照组的44.16%和64.56%(P<0.05)。与空载组相比,GCLC过表达组GCL酶活性和GSH含量均升高,分别为4.32 U/mgprot和7.41μmol/gprot。与空载组相比,空载染毒组GCL酶活性和GSH含量均降低(P<0.05);GCLC过表达染毒组GCL酶活性和GSH含量高于空载染毒组(P<0.05)。(2)GST酶活性检测结果显示,与正常对照组相比,MCLR染毒组的GST酶活性下降(P<0.05)。GCLC过表达组GST酶活性高于空载组,GCLC过表达组GST酶活性是空载组的1.2倍(P<0.05)。与空载组相比,空载染毒组GST酶活性下降(P<0.05);GCLC过表达染毒组GST酶活性高于空载染毒组(P<0.05)。(3)8-OHdG、MDA水平检测结果显示,与正常对照组相比,MCLR染毒细胞8-OHdG、MDA水平均升高(P<0.05)。GCLC过表达组8-OHdG、MDA水平均低于空载组(P<0.05)。与空载组相比,空载染毒组8-OHdG和MDA水平均升高(P<0.05);GCLC过表达染毒组8-OHdG和MDA水平均低于空载染毒组(P<0.05)。(4)CAT和SOD酶活性检测结果显示,MCLR染毒细胞CAT和SOD酶活性均低于正常对照组(P<0.05)。GCLC过表达组CAT和SOD酶活性与空载组相比没有差异(P>0.05)。与空载组相比,空载染毒组CAT和SOD酶活性均降低(P<0.05);且GCLC过表达染毒组CAT和SOD酶活性均高于空载染毒组(P<0.05)。(5)PP2A酶活性检测结果显示,MCLR染毒组PP2A酶活性下降至正常对照组的68.01%(P<0.05)。GCLC过表达组PP2A酶活性与空载组没有差异(P>0.05)。与空载组相比,空载染毒组PP2A酶活性下降了29.86%(P<0.05);且GCLC过表达染毒组PP2A酶活性高于空载染毒组(P<0.05)。结论:1.长期低剂量MCLR暴露可抑制WRL68细胞的PP2A酶活性,降低GCLC蛋白表达和GSH水平,导致DNA氧化损伤,使细胞发生恶性转化和体外迁移侵袭。2.GCLC过表达可以增强GCL活性,提高GSH水平,抑制DNA氧化损伤,抑制MCLR所致恶性转化细胞的恶性程度和迁移侵袭能力,减弱MCLR引起的PP2A酶活性抑制,提示GCLC可通过诱导氧化应激而参与MCLR所致WRL68细胞恶性转化过程。