蛋白质结构是蛋白质功能的基础;蛋白质真实存在于溶液中,其结构具有动态性,蛋白质根据不同的环境或者不同的信号调整自身的结构,以发挥其特定的功能。因此蛋白质动态结构信息对于人们深层次地探索各种生命活动的奥秘,例如疾病的发生、诊断和治疗等提供重要的理论依据。目前关于蛋白质动态的研究集中在主链上,主要方法是基于核磁共振的实时检测、弛豫扩散、酰胺交换等,涵盖了10-6-103 s时域范围内的动态信息。对于10-12-10-6s时域范围的侧链动态,由于缺乏有效的方法和技术,鲜少有报道。残余偶极耦合是新发展的一种核磁共振技术,能够识别10-12-10-3 s的动态,为蛋白质侧链动态的研究提供了可能。因此开发基于残余偶极耦合作用的蛋白质侧链动态研究方法是本论文的重点。第一章介绍蛋白质的核磁共振研究现状、残余偶极耦合作用的基本原理、蛋白质侧链动态的研究思路。核磁共振方法是获得蛋白质真实结构的最有效方法,它不仅解析蛋白质在溶液中的结构、而且表征蛋白质在溶液中的动态。残余偶极耦合是指在分子的运动受到限制时,两偶极子之间的偶极耦合常数没有完全被平均掉,而是被平均为较小的残留值。与NOE、二面角和J耦合常数等结构约束不同,残余偶极耦合提供蛋白质分子内各个化学键的取向信息及长程的结构信息,而且蕴含了分子内10-12-10-3 s的动态信息。由于残余偶极耦合是在溶液中由于部分定向排列而导致消除不完全的空间各向异性偶极耦合的分子中两个偶极子之间的作用,因此需要将蛋白质溶解于具有一定程度各向异性的溶剂中以使之产生微弱的空间取向特异性,通常称之为定向排列介质。蛋白在定向排列介质中的排列张量由一个对称的3×3矩阵描述,通常称其为Saupe矩阵;矩阵中的5个元素是正交的,因此最多可以获得五个非线性的定向排列张量。若要提取残余偶极耦合作用中蛋白质分子详细的动态信息,那么需要尽可能多的具有非线性定向排列张量的定向排列介质（最多五个）。蛋白质侧链的结构通常用χ系列二面角定义,如χ1、χ2、χ3等;其中,χ1与主链最近,χ1的变化对蛋白质侧链影响最大,因此本论文关于蛋白质侧链动态方法的研究主要对象是二面角χ1。χ1的取值范围是0°-360°;蛋白质分子中的一个氨基酸残基,若其χ1每隔1°保存一个结构,那么可以获得360个蛋白质结构;蛋白质在定向排列介质中,上述360个结构中χ1相关的残余偶极耦合作用大小（1D）是确定的,根据式子（?）Pi1Dical-1Dobs=Δ,系统搜索最合理的系列分布分数Pi值,使得Δ最小,由-得到蛋白质侧链二面角χ1及其分布分数的对应曲线,其中包含了二面角χ1的位置、动态范围和动态宽度等信息;1Dobs值的数量及准确性直接决定了计算二面角χ1动态的结果。因此,欲根据上述方法获得可信的二面角χ1动态,必须具备的条件是:1、尽可能多的具有非线性定向排列张量的定向排列介质（最多五个）,提供多组1Dobs值;2、设计脉冲核磁共振实验,采集准确可靠的χ1相关1Dobs值。第二章的主要内容是残余偶极耦合定向排列介质的研究。通过不同定向排列介质条件的优化及定点突变技术,获得了三个具有非线性定向排列张量的定向排列介质。以模式蛋白泛素ubiquitin为研究对象,选取了三种常用的定向排列介质聚丙烯酰胺凝胶gel、聚乙二醇-己醇混合物PEG和带正电的磷脂双分子层胶束bicelle,通过调整定向排列介质的浓度及温度等,获得蛋白质ubiquitin在定向排列介质中稳定存在的样品,并且残余偶极耦合作用的大小适中（1Da（HN-N）为10 Hz）。结果显示,ubiquitin 在 5.5%（w/v）gel、4.5%（v/v）PEG、6.5%（w/v）带正电的 bicelle 中较稳定,其定向排列张量具有较好的正交关系,排列张量大小1Da（HN-N）分别为10.32 Hz、9.65 Hz 和 9.87 Hz。由于采用了带正电荷的bicelle定向排列介质,蛋白和介质之间存在一定的静电相互作用,因此根据ubiquitin表面电荷分布,设计了 9种不同表面电荷分布的突变体（E64R、E16K、E16A、T14E、T12K、I44K、T14K、T12E、E64A）,尝试通过改变ubiquitin表面电荷分布,获得在带正电荷的bicelle中不同的定向排列张量。结果显示,上述9种突变体在带正电荷bicelle定向排列介质中的定向排列张量具有很好的相关性和一致性,这可能是因为单点突变对表面电荷的改变还不足以很好的调整蛋白和介质之间的相互作用。第三章的主要内容是残余偶极耦合作用测定方法的研究。针对不同类型的蛋白侧链χ1相关的残余偶极耦合作用1D,设计脉冲核磁共振实验,采集1Dobs实验数据,评估其可靠性。蛋白质侧链χ1相关的残余偶极耦合作用1D包括1DCα-Cβ、1DCβ-Hβ2、1DCβ-Hβ3、1DCβ-Cγ（精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸、酪氨酸）;或者1DCα-Cβ、1DCβ-Hβ、1DCβ-Cγ1、1DCβ-Cγ2（异亮氨酸、缬氨酸）;或者1DCα-Cβ、1DCβ-Hβ、1DCβ-Cγ（苏氨酸）。根据不同类型的残余偶极耦合作用1D,设计①非恒时演化的1H-13C HSQC脉冲序列收集1DCα-Cβ;②恒时演化的1H-13C CT-HSQC脉冲序列收集具有芳香侧链氨基酸残基的1DCβ-Cγ;③非恒时演化的1H-13C HSQC脉冲序列收集具有甲基侧链氨基酸残基的1DCβ-Cγ;④CT-HN（COCA）CB 和⑤DEPT-filtered 1H-13C·CT-HSQC 收集具有β-CH2氨基酸残基的（1DCβ-Hβ2+1DCβ-Hβ3）和1DCβ-Hβ2、1DCβ-Hβ3。不同的脉冲实验需要不同的蛋白质样品,对于①、②和③实验,表达纯化13C-15N双标记蛋白ubiquitin样品,溶解在重水中;对于④实验,表达纯化13C-15N双标记蛋白ubiquitin样品,溶解在水中;对于⑤实验,表达纯化部分氘代的2H-13C-15N三标记蛋白ubiquitin样品,溶解在重水中。制备上述蛋白在4.5%（v/v）PEG和6.5%（w/v）bicelle两种定向排列介质中的样品,利用①-⑤脉冲实验,收集蛋白质侧链χ1相关的残余偶极耦合作用1D。结果显示,④CT-HN（COCA）CB和⑤DEPT-filtered 1H-13C CT-HSQC两实验分别得到的（1DCβ-Hβ2+1DCβ-Hβ3）和1DCβ-Hβ2、1DCβ-Hβ3具有良好的相关性,说明这些数据可信;由于CT-HN（COCA）CB实验只能获得1DCβ-Hβ2与1DCβ-Hβ3之和,DEPT-filtered 1H-13C CT-HSQC实验中一些氨基酸存在谱峰重叠问题,故两实验数据可以互为补充。缬氨酸中,Hβ、Cα、Cγ1、Cγ2四原子与Cβ直接相连,形成一个四面体结构,Cβ处于四面体的中心,因此Cβ相关的1D之和应为零,即∑=（1DCβ-Hβ/10+1DCα-Cβ+1DCβ-Cγ1+1DCβ-Cγ2）=0。据此计算得到V5、V17、V70（V26存在谱峰重叠）在4.5%（v/v）PEG和6.5%（w/v）bicelle两种介质中的∑值,该值基本小于1 Hz,表明不同的蛋白侧链χ1相关1D值之间具有良好的相关性,这些1D值是准确可靠的。