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1.研究背景和目的人类基因组外显子数据量仅占总量的1%(约30 Mb),相比全基因组测序,全基因组外显子测序(WES)技术可以检测到更多的低频突变和罕见突变,同时可以大幅度降低测序成本,缩短实验周期。WES是发现、甄别和筛选肿瘤相关致病基因最有效的方法。通过该技术已经找到了很多人类疾病的致病基因和驱动基因,其中一部分已经用于临床的靶向治疗。目前,WES已经广泛用于肿瘤的研究,让我们对肿瘤发生的分子机制有了进一步了解,全基因组外显子测序通常选择外周血DNA或癌旁组织DNA中作为正常对照,但是经常会出现不完全一致的结果。所以肿瘤领域对于如何选择正常对照,历来存在争议。对消化道类空腔脏器的肿瘤来说,虽然癌旁组织形态学正常,但是我们实验室及其他研究已经发现形态正常的上皮组织其实已经发生分子改变。通过文献调研,我们发现针对同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血全基因组外显子测序结果对比的研究尚无报道。本论文是我们在做贲门腺癌全基因组测序的时增做的同一个体贲门腺癌和癌旁组织及外周血三种样品的全基因组外显子测序结果对比研究,目的是为贲门腺癌等正常对照组的选择提供指导性意见。2.材料与方法2.1 样品的准备本研究获得了患者及家属的知情同意和相关机构的审查和批准。我们共收取10位贲门腺癌患者的癌组织、癌旁组织和外周血。将每位患者的癌和癌旁配对,癌和外周血配对,以及癌旁和外周血配对,为进行全基因组外显子测序做准备,所收取的样品在-80℃深低温冰箱存储备用。2.2全基因组外显子测序的实验流程DNA样品的检测和质控→用破碎仪使DNA断裂为小片段→在DNA末端进行修复、磷酸化和加A尾→连接接头→用探针杂交捕获外显子区域的序列→除去未结合的DNA片段→DNA文库质量检测→Hiseq PE150上机测序2.3 分析方法2.3.1 测序数据质量评估通过对原始测序数据的错误率、对比率和数据量进行统计评估,符合标准后方能进行后续的分析,否则需要重新建库和加测。2.3.2 变异信息的收集和分析将高质量的原始测序序列与人类的参考基因序列进行比对,过滤掉样本中的胚系突变,得到贲门腺癌成对样品中检测到的体细胞突变(Somatic Mutation),并对其检测出的体细胞突变和高频突变基因进行分析。3.结果3.1 同一个体贲门腺癌vs癌旁、贲门腺癌vs外周血和癌旁vs外周血的体细胞突变数目贲门腺癌vs癌旁组织(TvsN)进行全基因组外显子测序,贲门腺癌组织中发现8525个SNV、131个InDel和1150个CNV;贲门腺癌vs外周血(TvsB)进行全基因组外显子测序,贲门腺癌组织中发现8674个SNV、134个InDel和625个CNV;癌旁组织vs外周血(NvsB)进行全基因组外显子测序,癌旁组织中发现4297个SNV、42个InDel和362个CNV。3.2 同一个体贲门腺癌vs癌旁、贲门腺癌vs外周血和癌旁vs外周血发生SNV的基因数目(突变频率VAF>0.05)贲门腺癌vs癌旁(TvsN)中,贲门腺癌组织中发生SNV突变且VAF大于0.05的基因数目为2390个;贲门腺癌vs外周血(TvsB)中,贲门腺癌组织中发生SNV突变且VAF大于0.05的基因数目为2433个;癌旁vs外周血(NvsB)中,癌旁组织中发生SNV突变且VAF大于0.05的基因数目为785个。3.3 贲门腺癌vs外周血与癌旁vs外周血中发生相同SNV的基因同一个体贲门腺癌vs外周血,癌旁vs外周血对比,G070、G072、G074和G075样本的T和N中发生相同SNV的基因,G070样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是SFN、ZNF746、TDG、TP53TG3D;G072样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是FAHD2B;G074样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是 SIMC1、FOXO3、SLC2A3、TDG、KRTAP3-3、CSTF1;G075样本的T和N中共有的单核苷酸突变的基因是CSDE1、OR2T4、OR2T2、AMIGO3、HTR1B、PTEN、PRH2、C17orf97、ROCK1、TMC4、ZNF416、PABPC1。3.4 贲门腺癌vs外周血的高频突变基因TvsB中共找到19个高频突变基因:TP53(75%)、ZNF208(38%)CNTN6(38%)、RBM42(25%)、YBX3(25%)、UNC80(25%)TRIM64C(25%)、RELN(25%)、RBBP8NL(25%)、CYP8B1(25%)CAAP1(25%)、ANKRD30A(25%)、SPAG16(12%)、PANK2(12%)NAT6(12%)、NARFL(12%)、KIR3DL1(12%)、DMRTB1(12%)CFHR2(12%)。3.5 贲门腺癌vs癌旁的高频突变基因TvsN中共找到15个高频突变基因:TP53(62%)、ZNF208(38%)、CNTN6(38%)、YBX3(25%)、TRIM64C(25%)、RBBP8NL(25%)、CYP8B1(25%)、SPAG16(12%)、RBM42(12%)、PANK2(12%)、NAT6(12%)、NARFL(12%)、KIR3DL1(12%)、DMRTB1(12%)、CFHR2(12%)。3.6 癌旁vs外周血的高频突变基因NvsB中共找到1个高频突变基因:PANK2(12%)。4.结论贲门腺癌用外周血做正常对照比癌旁组织更合适。