【摘 要】
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禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是危害养禽业的主要病原之一,给养禽业带来了严重的经济损失。AIV血清型众多,基因组高度变异,需要根据病毒的变异情况不断更换流感病
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禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)是危害养禽业的主要病原之一,给养禽业带来了严重的经济损失。AIV血清型众多,基因组高度变异,需要根据病毒的变异情况不断更换流感病毒疫苗株,频率大,费时费力,往往疫苗的研发速度跟不上病毒的变异速度。AIV的NP蛋白具有高度保守性(Saha S et al.,2006;Ohba K et al.,2007;Altstein A D et al.,2006)。具有种群和型特异性的NP蛋白是诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应的主要抗原,并且至少包括3个独立的抗原位点。MHC分子介导的细胞免疫在抗病毒感染中具有重要的作用,细胞免疫的重要组成部分为T细胞表位,而T细胞表位具有MHC限制性,即不同的MHC分子结合的抗原肽是不同的。NP蛋白的CTL表位与MHC I类分子结合后可以被CD8+T细胞识别,引起T淋巴细胞增殖,并能够激活IFN-γ分泌。因此可以通过检测细胞分泌IFN-γ含量以及表达IFN-γ的mRNA的量来验证的T细胞表位是否正确。本研究通过生物结构学技术预测了一株流行株H5N1 AIV NP蛋白的4个潜在的T细胞表位多肽(NP120-128、NP163-172、NP85-92、NP67-74)。为验证4条多肽的免疫原性,构建了含有NP基因的重组质粒pCAGGS-NP。间接免疫荧光和Western blot结果表明NP蛋白在293T细胞中可以获得表达。pCAGGS-NP免疫SPF鸡后能诱导鸡体产生特异的NP抗体。在合成的4条短肽中,多肽NP67-74体外刺激免疫过pCAGGS-NP的鸡脾淋巴细胞可以显著提高脾淋巴细胞IFN-γ的分泌量;流式细胞术检测结果表明:NP67-74能刺激CD8+T淋巴细胞的增殖(10.6%),提示短肽NP67-74能在体外诱导活化鸡淋巴细胞产生CTL,可能是AIV NP的CTL表位。该研究结果对流感病毒免疫机制和通用疫苗研究具有借鉴意义。为进一步探索T细胞表位NP67-74对流感4M2e-MAP合成肽疫苗的免疫效果,我们采用化学合成方法使NP67-74偶联载体蛋白KLH合成了多肽NP67-74-KLH。本实验将多肽NP67-74-KLH和4M2e-MAP添加完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂后制备疫苗免疫BALB/c小鼠,通过攻毒保护试验来评价表位多肽NP67-74-KLH是否能够影响4M2e-MAP合成肽疫苗的免疫效果。攻毒以后小鼠体重变化曲线说明:联合免疫多肽疫苗NP67-74-KLH和4M2e-MAP的实验组小鼠体重变化趋势比单一免疫4M2e-MAP多肽疫苗更加趋于平稳,并且联合免疫试验组小鼠的体重恢复较快。荧光定量和肺部组织的病理切片结果均表明:复合多肽(NP67-74-KLH和4M2e-MAP)免疫后能在一定程度上抑制流感病毒在小鼠脏器肺中的复制能力并能够降低病毒对肺部的损伤程度。这为研发抗流感的多肽疫苗提供了一条新的思路。
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