【摘 要】
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肺表面活性蛋白B（SP-B）是肺表面活性物质中不可缺的疏水性蛋白之一,有助于促进磷脂分子扩散,增加单分子膜的稳定性,具有调节肺泡气液界面表面张力的功能。Clara细胞分泌蛋白（Clara cell secreted protein,CCSP）是由细支气管、终末细支气管黏膜上的Clara细胞分泌产生的亲水性蛋白,是肺内源性抗炎物质之一,其主要抗炎机制为竞争性抑制分泌型磷脂酶A2-IIA（sPLA2-
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“修饰 SP-B α-helix改善 ALI 时 SP 功能的研究”，项目编号:81471865。；
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肺表面活性蛋白B（SP-B）是肺表面活性物质中不可缺的疏水性蛋白之一,有助于促进磷脂分子扩散,增加单分子膜的稳定性,具有调节肺泡气液界面表面张力的功能。Clara细胞分泌蛋白（Clara cell secreted protein,CCSP）是由细支气管、终末细支气管黏膜上的Clara细胞分泌产生的亲水性蛋白,是肺内源性抗炎物质之一,其主要抗炎机制为竞争性抑制分泌型磷脂酶A2-IIA（sPLA2-IIA）。急性肺损伤（ALI）过程中会大量释放分泌型磷脂酶A2-IIA水解细胞表面活性磷脂,产生花生四烯酸等炎症因子,最终导致肺泡Ⅱ型上皮细胞形态、功能发生变化,表面活性物质合成减少,而SP-B合成的减少、构象改变及活性的降低,会进一步加重ALI的病理过程。研究目的:本课题研究目的在于探究SP-B/CCSP融合蛋白对LPS诱导的ALI中sPLA2-IIA水解活性的影响,肺泡上皮细胞的保护作用,为ALI替补治疗开发新型的基因工程药物提供一定的实验依据和参考。研究方法:（1）SP-B/CCSP融合蛋白生物信息学分析,通过对SP-B/CCSP蛋白疏水性和二级结构的分析,了解SP-B/CCSP融合蛋白结构特性。（2）从大鼠肺组织中提取RNA,RT-PCR扩增CCSP基因,构建CCSP表达载体pEGFP-N2-CCSP,对重组质粒pEGFP-N2-SP-B进行双酶切,插入CCSP基因,构建SP-B/CCSP融合表达载体pEGFP-N2-SP-B/CCSP。（3）筛选重组载体最佳转染条件,将重组质粒pEGFP-N2-CCSP和pEGFP-N2-SP-B/CCSP转染至A549细胞和CCL-149细胞中,检测CCSP蛋白及SP-B/CCSP融合蛋白的表达,观察融合蛋白的荧光表达定位情况。（4）MTT法筛选sPLA2-IIA最佳作用浓度,sPLA2-IIA处理重组质粒转染细胞,检测花生四烯酸和TNF-α含量,分析SP-B/CCSP融合蛋白对sPLA2-IIA水解作用的影响。（5）用脂质体构建ALI细胞模型,LPS处理重组质粒转染细胞,进行细胞拉曼光谱扫描,分析SP-B/CCSP融合蛋白对细胞膜结构的影响,ELISA检测炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8的含量变化。研究结果:（1）对SP-B/CCSP蛋白进行疏/亲水性分析,发现CCSP为亲水性蛋白,SP-B为疏水性蛋白,两者进行融合后SP-B/CCSP蛋白仍然具有较强疏水性。SP-B/CCSP蛋白二级结构中含有61.1%的α-螺旋（Alpha helix）、37.1%的环状结构,1.7%无规卷曲。（2）从大鼠肺中提取肺总RNA,根据CCSP基因序列设计含有酶切位点的引物,通过PCR扩增,获得CCSP基因片段,大小约为309bp,通过Hind III、Eco RⅠ对pEGFP-N2进行双酶切,T4连接酶连接,筛选阳性克隆、测序,获得pEGFP-N2-CCSP重组质粒;pEGFP-N2-SP-B重组质粒,使用Hind III、Eco RⅠ对pEGFP-N2-SP-B进行双酶切,T4连接酶连接,筛选阳性克隆、测序,获得融合表达载体pEGFP-N2-SP-B/CCSP。（3）脂质体瞬时转染最佳转染条件为:质粒:Lip2000 1:1（ng:μL）,转染时间为4h。将重组质粒转入A549和CCL-149细胞中表达,Western blot结果显示,CCSP重组蛋白大小约为39.46 k Da,SP-B/CCSP融合蛋白大小约为47.05 k Da。细胞荧光定位结果显示,CCSP重组蛋白在A549和CCL149细胞质中均匀分布,而SP-B重组蛋白和SP-B/CCSP融合蛋白在细胞中呈膜倾向性分布。（4）sPLA2-IIA最佳作用浓度为0.1μg/m L,SP-B/CCSP融合蛋白组和CCSP蛋白组的花生四烯酸和TNF-α含量与阳性对照组相比都有所降低,并且,SP-B/CCSP融合蛋白组与CCSP蛋白组相比,花生四烯酸和TNF-α浓度降低49.0%、67.5%,说明SP-B/CCSP融合蛋白具有更强的抑制sPLA2-IIA水解膜磷脂的能力。（5）用LPS构建ALI细胞模型,筛选出LPS最优处理剂量为10 mg/L,拉曼光谱细胞扫描结果显示,pEGFP-N2-SP-B/CCSP转染细胞的细胞膜C-C骨架结构无序程度比pEGFP-N2-CCSP更低,磷脂侧链间的有序性增大,细胞膜结构更加稳定;LPS处理转染细胞后,各组转染细胞中的炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8含量增加,而SP-B/CCSP融合蛋白组和CCSP蛋白组中各炎症因子的浓度与阳性对照组相比都有所下降,并且,SP-B/CCSP融合蛋白组与CCSP蛋白组相比,TNF-α、IL-6、IL-8的含量降低61.2%、37.6%、42.7%,说明CCSP/SP-B融合表达细胞具有更强的抑制炎症因子产生的能力。
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