猪流行性腹泻是一种高传染性和死亡率的传染病,易导致规模化猪场的巨大经济损失。其病原是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV),临床表现为严重的腹泻、呕吐和脱水等,猪的各个年龄段都易感,且日龄越小特别是哺乳仔猪发病率高,死亡率也高。目前药物和疫苗尚不能完全治愈和预防PEDV。肠道黏膜屏障完整性与腹泻发生密切相关,黏蛋白2(Mucin2,MUC2)和三叶因子1(Trefoil factor 1,TFF1)是由胃肠道分泌的蛋白,参与形成肠黏液屏障,在胃肠黏膜保护和修复中发挥着重要作用,它们可以在胃肠道上皮表面形成保护层,保护和润滑上皮表面,维持上皮的完整性,帮助细胞粘附,防止病原体、毒素和异物的入侵。基于MUC2和TFF1的生物学功能,本研究分析了猪MUC2和TFF1基因表达水平对抵抗PEDV感染的调控作用,同时探究启动子区DNA甲基化对MUUC2和TFF1基因表达的影响。试验结果如下:1.观察发生猪流行性腹泻后仔猪肠道黏膜变化,同时在组织和细胞水平上检测了MUC2和TFF1基因的表达变化,并在细胞水平检测RNA干扰MUC2和TFF1对PEDV病毒复制的影响。石蜡切片结果显示,腹泻仔猪肠道绒毛受损、脱落,高度、密度都下降,固有层暴露;而正常仔猪肠道黏膜屏障结构完整,层次分明。荧光定量PCR结果表明:腹泻组小肠(十二指肠、空肠、回肠)MUC2基因表达水平均极显著高于正常组(P<0.01);TFF1基因在十二指肠中差异不显著,而在空肠和回肠中,腹泻组TFF1表达量极显著高于正常组(P<0.01)。此外,用PEDV(0.1 MOI)持续侵染IPEC-J2细胞,检测不同时间段MUC2和TFF1的表达变化。结果显示,MUC2基因在侵染24 h时表达水平呈现显著的上调(P<0.05);TFF1基因表达则呈现先下降后上升的趋势,在侵染48 h呈现出极显著的上调表达(P<0.01)。最后本研究利用RNAi分别沉默MUC2和TFF1表达后,均发现PEDV病毒基因组M基因的表达量极显著升高(P<0.01)。这些结果表明MUC2和TFF1的高表达有利于仔猪抵抗PEDV侵染。2.通过重亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)分别检测MUC2和TFF1启动子区DNA甲基化程度,分析MUC2和TFF1基因启动子区甲基化与mRNA的表达关系,并利用双荧光素酶报告基因系统,检测甲基化状态对启动子活性的影响。结果表明MUC2和TFF1基因启动子甲基化与基因的表达水平呈现负相关,其中MUC2 mC-5位点和TFF1 mC-6位点的甲基化与mRNA的表达存在显著的负相关(P<0.05)。双荧光素酶报告基因系统检测发现DNA甲基化能极显著降低MUC2和TFF1启动子活性(P<0.01)。3.通过对MUC2和TFF1启动子元件进行预测分析,发现MUC2 mC-5和TFF1 mC-6位点分别位于转录因子YY1和C/EBPα结合域内。通过染色质免疫共沉淀(ChIP)试验验证了转录因子YY1与MUC2基因启动子序列结合,转录因子C/EBPα与TFF1基因启动子序列结合。分别进行转录因子YY1和C/EBPα干扰后,MUC2和TFF1基因表达量均呈现显著的下降(P<0.05),由此推测MUC2 mC-5和TFF1 mC-6位点甲基化可能抑制了转录因子与启动子DNA的结合,进而抑制了MUUC2和TFF1基因的表达。综合以上结果,PEDV感染仔猪后肠道黏膜受损,黏液屏障被破坏,同时MUC2和TFF1基因较正常仔猪呈现出上调表达的趋势,并且MUC2 mC-5位点和TFF1 mC-6位点甲基化可能阻碍了转录因子与启动子的结合,抑制了 MUC2和TFF1基因的表达水平,从而提高了仔猪对PEDV的易感性。本研究从表观遗传学层面揭示了 DNA甲基化对仔猪抵抗PEDV感染的分子调控机制,为以后从肠道黏膜屏障角度研究PEDV的致病机理提供了理论参考。