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干细胞是一群具有多向分化潜能的细胞,发育上的全能性赋予其在临床上广泛的应用前景,尤其是其在组织和器官重建中的应用更是备受关注。那么,在体外干细胞的增殖过程中,如何来维持其未分化状态以及在组织培养时如何诱导其向特定的细胞类型分化,从而产生需要的组织和器官是目前亟待解决的问题。Nanog是2003年发现的一个转录因子,特异性表达于全能性细胞中。研究发现,Nanog在干细胞的全能性维持、早期分化以及成体细胞的去分化过程中起到至关重要的作用。在本研究中,我们以Nanog启动子为靶点,建立了 Nanog启动子荧光素酶报告基因筛选模型,通过荧光素酶活性检测筛选出调节Nanog启动子活性的中药化合物,并初步探讨了目标化合物调节Nanog基因表达的可能的分子机制,得到了以下结果。1.成功构建了pcDNA3-Nanog真核表达载体。通过RT-PCR方法克隆了Nanog基因的编码序列,连接入PMD18-T克隆载体,经鉴定正确后亚克隆入pcDNA3中,构建了pcDNA3-Nanog真核表达载体。经测序证明重组真核表达载体pcDNA3-Nanog构建成功。2.构建了Nanog启动子荧光素酶报告载体。从A549细胞基因组中通过PCR方法扩增了 1931bp的Nanog基因5’端非编码序列,并连接入pGL3-basic载体,构建了Nanog启动子的荧光素酶报告载体pGL3-NanogP。经荧光素酶活性检测结果证明,我们所钓取的序列具有较高的活性,可以用于后续化合物的筛选实验。3.筛选Nanog基因表达调节剂。运用荧光素酶报告基因活性检测法,对本实验室保存的400多种中药化合物进行了筛选。经初筛和复筛实验发现,化合物NA202对Nanog启动子活性有较明显的促进作用,NI125对Nanog启动子活性有较明显的抑制作用,并在HEK-293T细胞和P19细胞中验证了 NA202确实增加了 Nanog蛋白的表达,而NI125下调了Nanog蛋白的表达。4.NA202、NI125对细胞内信号通路的影响。通过转录因子荧光素酶报告基因法以及免疫印迹分析,我们发现化合物NA202、NI125通过不同的信号通路发挥作用。NI125可显著抑制NF-κB应答性荧光素酶报告载体的活性,并且进一步研究证实,NI125显著下调了 ERK和NF-κB上游蛋白IκB的磷酸化水平,而NA202上调了细胞质中IκκB的磷酸化水平。这些结果提示,NI125抑制Nanog基因表达可能与其下调ERK/MAPK以及NF-κB信号有关。NA202则可能是通过激活NF-κB信号调控Nanog的表达。